發(fā)布時間：2017-08-14 01:10

  本文關(guān)鍵詞：甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌臨床分離株的分子分型及耐藥性分析

  更多相關(guān)文章： 甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌 流行病學(xué) 分子分型 多重耐藥 藥敏試驗

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),簡稱金葡菌,不僅是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染的重要病原菌,而且在社區(qū)獲得性感染中,金葡菌也是引起皮膚、軟組織等感染的主要原因。金葡菌的致病作用多樣,可引起多種感染性疾病,從輕度的皮膚、軟組織感染到危及生命的敗血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎等,嚴(yán)重危害人類健康。金葡菌除可以表達(dá)多種毒力因子致病外,更為人們所忌憚的是其對抗生素耐藥的快速形成能力。近年來,隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,特別是廣譜抗生素的使用,金葡菌的耐藥形勢日益嚴(yán)峻,耐3種以上抗生素的多重耐藥菌檢出比例越來越高。以往的研究大多關(guān)注于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA),然而仍然有相當(dāng)部分的感染是由甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillinsusceptible S.aureus,MSSA)引起,在我國MSSA感染約占金葡菌感染的40%,但是對于MSSA的分子特征還缺乏了解。在分子型別上,與MRSA相比,MSSA表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性。在特定地區(qū),MSSA的流行無明顯的優(yōu)勢克隆,常常多種分子型別的菌株并存,我國不同的研究中報道的主要MSSA型別也存在差異。研究發(fā)現(xiàn),MSSA攜帶的多種毒力因子,如腸毒素、殺白細(xì)胞素等的表達(dá)水平比MRSA高。此外,MSSA菌獲得SCCmec耐藥盒后即轉(zhuǎn)化為MRSA,是MRSA的重要來源。一般認(rèn)為,MSSA對除青霉素外的大多數(shù)抗生素敏感,然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)MSSA的耐藥水平逐年升高,多重耐藥菌株檢出率持續(xù)上升。分析MSSA臨床菌株的分子特征和耐藥表型對于鑒定菌株間親緣關(guān)系、有效控制MSSA的感染和傳播具有重要現(xiàn)實意義。在我國,MSSA感染仍然占金葡菌感染的40%左右,然而,現(xiàn)有的研究報道常與對MRSA的分析同時進(jìn)行,以MRSA為主,尚未見專門針對MSSA的研究報道,對MSSA的分子特征所知有限。本研究對2012年6月至2013年12月期間收集于重慶和烏魯木齊兩座城市的115株MSSA臨床菌株進(jìn)行了研究,綜合運用多種分子分型方法,分析菌株的分子特征,在此基礎(chǔ)上對菌株的抗生素耐藥譜進(jìn)行檢測,探討菌株分子特征與耐藥表型之間的關(guān)系。所得結(jié)果不僅可以在一定程度上揭示我國MSSA的流行現(xiàn)狀,探討其分子特征與耐藥表型的關(guān)系,也可以豐富我國金葡菌的分子流行病學(xué)資料,為進(jìn)一步研究金葡菌耐藥機(jī)制,指導(dǎo)臨床抗生素合理應(yīng)用,防控金葡菌感染提供重要實驗依據(jù)。主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下:1.MSSA的分子分型研究(1)葡萄球菌A蛋白基因多態(tài)性分析(spa分型):用PCR方法擴(kuò)增spa基因的X區(qū),測序后獲得連續(xù)的24bp重復(fù)序列,從數(shù)據(jù)庫(http://spaserver.ridom.de/)中得到每個24bp重復(fù)序列相對應(yīng)的編號,再根據(jù)編號和排列順序確定菌株的spa型別。結(jié)果115株MSSA菌株共獲得45個spa型別,主要型別有t11413(8.7%,10株)、t571(6.1%,7株)和t7164(6.1%,7/115),這三種型別占所有菌株的20.9%,另有11株可能為新的spa型別。(2)多位點序列分析(MLST分型):根據(jù)金葡菌7個管家基因(arc,aro E,glp F,gmk,pta,tpi,yqi L)的多態(tài)性確定其型別。首先分別PCR擴(kuò)增每株菌的7個管家基因,測序后提交數(shù)據(jù)庫(http://saureus.mlst.net/)獲得每個管家基因的序號,然后按順序依次排列,獲得其ST型別,與已知的金葡菌流行株進(jìn)行比較。115株MSSA菌可分為26個ST型,其中主要型別有ST121(11.3%,13株)、ST15(11.3%,13株)、ST7(10.4%,12株)、ST22(10.4%,12株)、ST398(7.0%,8株)、ST188(6.1%%,7株)以及ST88(5.2%,6株),占所有MSSA菌株的61.7%。(3)金葡菌附屬基因調(diào)節(jié)子(agr)分型:金葡菌agr位點的可變區(qū)包含編碼Agr D的基因序列、編碼Agr B的C末端2/3的序列和編碼Agr C的N末端的部分序列。不同金葡菌菌株的agr位點可變區(qū)呈現(xiàn)出多態(tài)性,利用這一點可將金葡菌分為4種不同的agr型別。115株MSSA菌株共檢出agr I型71株(61.7%)、agr II型17株(14.8%)、agr III型13株(11.3%)、agr IV型14株(12.2%)。(4)脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型:先將金葡菌包埋于瓊脂中,然后用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對細(xì)菌的整個染色體進(jìn)行酶切,電泳時通過不斷交替變換電場方向和脈沖時間,使酶切片段在電泳系統(tǒng)中得到較好的分離,最后電泳結(jié)果進(jìn)行聚類分析。結(jié)果107株MSSA分離株可分為10個聚類組,依次命名為A-J,其中A型(26.2%,28/107)、B型(26.2%,28/107)和F型(23.4%,25/107)為優(yōu)勢型別,占所有MSSA菌株的75.8%(81/107)。8株ST398型菌株無法分型。(5)殺白細(xì)胞毒素毒力基因(pvl)檢測:115株MSSA中有33株顯示pvl基因陽性,陽性率為28.7%。2.MSSA的耐藥性分析檢測了115株MSSA對13種臨床常用抗生素的耐藥情況,結(jié)果所有菌株對苯唑西林,利奈唑胺,萬古霉素,替考拉寧都敏感;僅有1株對利福平中介耐藥;對復(fù)方新諾明(28.7%,33/115)、四環(huán)素(18.3%,21/115)、慶大霉素(7.8%,9/115)、環(huán)丙沙星(5.2%,6/115)、左氧氟沙星(2.6%,3/115)呈不同程度的低水平耐藥;而對青霉素(83.4%,96/115)、紅霉素(60.0%,69/115)和克林霉素(51.3%,59/115)呈高水平耐藥。通常將對3類以上(含3類)抗生素耐藥的細(xì)菌定義為多重耐藥菌(multidrug-resistant,MDR)。我們的檢測表明47.8%(55/115)的MSSA菌株為MDR菌株,其中大多數(shù)(89.1%,49/55)至少對青霉素、紅霉素和克林霉素3種抗生素耐藥。用PCR方法檢測所有MSSA菌株這3種抗生素耐藥基因的攜帶情況,結(jié)果青霉素耐藥基因bla Z的攜帶率為91.3%(105/115),紅霉素、克林霉素耐藥基因erm A、erm C攜帶率分別為30.4%(35/115)、92.2%(106/115)。結(jié)合MSSA菌株的分子特征來看,4株ST943型菌都為MDR菌株;13株ST121型菌中有9株為MDR菌株(69.2%),而且大多數(shù)(88.9%,8/9)有共同的耐藥譜(PEN-ERYCLI);3株ST398型MDR菌株都對至少4類抗生素耐藥。此外,大多數(shù)(76.0%,19/25)PFGE F型菌株屬于多重耐藥菌,其中包含一株(ST45-t1081)對7種抗生素耐藥。綜上所述,本研究通過分子分型分析揭示了我國重慶及烏魯木齊地區(qū)MSSA的主要種群結(jié)構(gòu),通過耐藥性分析發(fā)現(xiàn)了較高的MDR檢出率。所分析的MSSA臨床菌株具有高度的遺傳多樣性,優(yōu)勢流行克隆不明顯,除國內(nèi)經(jīng)常存在的t571外,t11413和t7164也占據(jù)一定地位。具有高毒力、高耐藥性的ST121克隆在我國以往的報道中少見,在本研究中具有一定優(yōu)勢,值得高度關(guān)注。上述結(jié)果為了解MSSA的流行病學(xué)特征提供了重要實驗依據(jù),盡管MRSA仍然是金葡菌感染的主要問題,但是MSSA因為其較強(qiáng)的毒力和日益增長的耐藥性也應(yīng)引起足夠的重視。
【關(guān)鍵詞】：甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌 流行病學(xué) 分子分型 多重耐藥 藥敏試驗
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 1.1 選題緣由13
• 1.2 研究背景13-14
• 1.3 研究意義14-15
• 1.4 研究內(nèi)容15
• 1.5 方法15-17
• 第二章 MSSA臨床分離株的分子分型17-43
• 2.1 材料與方法18-30
• 2.2 結(jié)果30-40
• 2.3 討論40-43
• 第三章 MSSA臨床分離株的耐藥性分析43-52
• 3.1 材料與方法43-46
• 3.2 結(jié)果46-50
• 3.3 討論50-52
• 第四章 全文總結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 文獻(xiàn)綜述 金黃色葡萄球菌分子分型研究現(xiàn)狀60-80
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及參與的課題80-81
• 致謝81

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