本文關鍵詞：內(nèi)源性大麻素在大鼠神經(jīng)病理痛模型中鎮(zhèn)痛作用與谷氨酸—谷氨酰胺循環(huán)關系研究

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【摘要】：目的：觀察內(nèi)源性大麻素2-AG在大鼠保留性神經(jīng)損傷(spared nerve injury)神經(jīng)病理痛模型中鎮(zhèn)痛效應,確定劑量效應關系,計算半數(shù)有效量,并闡述其鎮(zhèn)痛效應的發(fā)生是否與抑制星形膠質細胞和神經(jīng)元細胞之間谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)有關。方法：成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠48只,體重180-220g,隨機分為8組(n=6),Normal組(空白組)：空白組不做任何處理；Sham組(假手術組)：分離暴露脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)后,僅穿線不結扎；SNI模型組：通過分離暴露坐骨神經(jīng)三個分支,結扎并切斷其中的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng),保留腓腸神經(jīng)完整來建立SNI模型,但不給予任何干預措施；N.S.組(生理鹽水組)：建立SNI模型成功后,鞘內(nèi)穿刺注射15μ1生理鹽水；2-AG干預1-4組：在建立SNI模型成功后,分別鞘內(nèi)注射 2-AG 50nmol、100nmol、200nmol、400nmol。于手術前1日(BL, base line),手術后1周(1week)及鞘內(nèi)給藥后15、30、45、60分鐘測定大鼠機械爪縮閾值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)。在最后一次行為學實驗結束后,立即迅速處死大鼠并取脊髓標本,進行形態(tài)學及Western-Blot檢測。采用免疫熒光雙標記法觀察Normal組大鼠、SNI模型組大鼠及SNI神經(jīng)病理痛模型2-AG干預后,內(nèi)源性大麻素受體CB1(cannabinoid receptor 1)、CB2 (cannabinoid receptor 2)在脊髓表達情況及與神經(jīng)元細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞共表達情況；Normal組大鼠、SNI模型組大鼠及SNI模型組大鼠在2-AG干預后谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的表達變化情況。Western-Blot實驗檢測大麻素受體CB1蛋白、CB2蛋白及GS蛋白表達量變化情況。結果：行為學研究發(fā)現(xiàn),Normal組與Sham組在術前及術后大鼠MWT均無統(tǒng)計學意義；與Normal組相比,SNI模型組大鼠MWT明顯下降(F(1,71)=3844.857,P0.001),在觀察期的(1week及15、30、45、60分鐘)時間點上也存在統(tǒng)計學意義(P0.05)；N.S.組與SNI模型組相比,大鼠MWT無統(tǒng)計學意義。鞘內(nèi)注射不同劑量的內(nèi)源性大麻素2-AG(50,100,200,400nmol;注射劑量15μ1)后,觀察到隨著2-AG藥物濃度的增加,對SNI誘導的大鼠神經(jīng)病理性觸誘發(fā)痛的抑制效應逐漸增強,且成劑量依賴關系。與SNI模型組相比,2-AG400 nmol、200 nmol、100nmol、50nmol組大鼠MWT的上升均有統(tǒng)計學意義(2-AG400 nmol:F(1,71)=100.898,P0.001；2-AG 200 nmol:F(1,71)=15.207,P=0.011； 2-AG 100 nmol:F(1,71)=20.214,P=0.006；2-AG 50 nmol:F(1,71)=36.554, P=0.002).通過線性回歸統(tǒng)計分析,得出2-AG在SNI神經(jīng)病理性疼痛模型中,鎮(zhèn)痛作用的半數(shù)有效量(ED50)值為227.25nmol.形態(tài)學研究顯示,與Normal組相比,神經(jīng)元細胞、星形膠質細胞以及小膠質細胞在SNI模型組均不同程度的被激活；在Normal組觀察到,CB1受體在神經(jīng)元、星形膠質細胞以及小膠質細胞均有表達,SNI組的CB1受體表達明顯增強,且主要與星形膠質細胞共表達；2-AG干預后,神經(jīng)元、星形膠質細胞以及小膠質細胞的表達減弱,同時CB1受體的表達亦減弱。在Normal組和SNI組均未觀察到CB2受體的表達。在Normal組觀察GS的表達,發(fā)現(xiàn)呈低表達；在SNI組,GS的表達明顯增強,主要在星形膠質細胞上表達；2-AG干預后,明顯的抑制了GS的表達和GS與星形膠質細胞的共表達。Western-blot檢測顯示,CB1受體在SNI組的表達明顯高于Normal組,具有統(tǒng)計學差異(P0.001),2-AG的干預未能影響CB1受體的表達；CB2受體在Normal組未檢測出表達,但在SNI組表達量明顯提高(P0.001),且2-AG的干預后,CB2受體蛋白的表達有所下降(P0.01)；同Normal組比較,GS蛋白在SNI組表達明顯提高(P0.001)；2-AG干預后,GS蛋白的表達明顯下降(P0.001)。結論：內(nèi)源性大麻素2-AG抑制了SNI誘導的神經(jīng)病理性觸誘發(fā)痛,該鎮(zhèn)痛效應的機制之一可能是通過內(nèi)源性大麻素2-AG作用于星形膠質細胞上大麻素CB1受體,抑制了星形膠質細胞與神經(jīng)元之間的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán),從而減少了神經(jīng)元突觸末梢興奮性神經(jīng)遞質谷氨酸的釋放來實現(xiàn)的,但是不能排除可能通過CB2受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應,同時2-AG通過作用于神經(jīng)元和小膠質細胞上的CB1受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應亦不能排除。
【關鍵詞】：內(nèi)源性大麻素 2-AG 神經(jīng)病理痛 星形膠質細胞 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R402;R-332
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 引言9-17
• 1.1 神經(jīng)病理痛的產(chǎn)生、傳導、主要臨床表現(xiàn)及形成機制9-10
• 1.2 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與神經(jīng)病理性疼痛10-13
• 1.3 星形膠質細胞在神經(jīng)病理性疼痛中的作用13-15
• 1.4 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)在神經(jīng)病理性疼痛中的作用15-17
• 第二章 材料與方法17-24
• 2.1 實驗動物17-18
• 2.2 主要儀器設備18
• 2.3 主要藥品及試劑18-20
• 2.4 模型建立20
• 2.5 機械痛覺測定20-21
• 2.6 鞘內(nèi)注射給藥21
• 2.7 免疫熒光檢測21-22
• 2.8 Wsetern-blot檢測22
• 2.9 實驗分組22-23
• 2.10 統(tǒng)計學分析23-24
• 第三章 結果24-31
• 3.1 行為學實驗結果24-25
• 3.1.1 Normal組、Sham組及SNI模型組大鼠MWT變化情況24
• 3.1.2 不同劑量2-AG對SNI模型大鼠痛敏行為反應抑制作用24
• 3.1.3 2-AG抑制SNI模型大鼠痛敏行為反應的ED_(50)值24-25
• 3.2 免疫熒光實驗結果25-29
• 3.2.1 星形膠質細胞標志物GFAP與CB1受體表達及共表達情況25-26
• 3.2.2 小膠質細胞標志物ox-42與CB1受體表達及共表達情況26-27
• 3.2.3 神經(jīng)元細胞標志物NeuN與CB1受體表達及共表達情況27-28
• 3.2.4 星形膠質細胞標志物GFAP與GS表達及共表達情況28-29
• 3.3 Western-blot實驗結果29-31
• 3.3.1 CB1受體表達情況29
• 3.3.2 CB2受體表達情況29-30
• 3.3.3 GS表達情況30-31
• 第四章 討論31-35
• 第五章 創(chuàng)新點與局限性35-36
• 5.1 本實驗創(chuàng)新點35
• 5.2 本實驗局限性35-36
• 第六章 結論36-37
• 參考文獻37-43
• 附錄一43-45
• 附錄二45-46
• 在學期間的研究成果46-47
• 致謝47

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本文編號：626318