本文關(guān)鍵詞：內(nèi)源性大麻素在大鼠神經(jīng)病理痛模型中鎮(zhèn)痛作用與谷氨酸—谷氨酰胺循環(huán)關(guān)系研究

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【摘要】：目的：觀察內(nèi)源性大麻素2-AG在大鼠保留性神經(jīng)損傷(spared nerve injury)神經(jīng)病理痛模型中鎮(zhèn)痛效應(yīng),確定劑量效應(yīng)關(guān)系,計(jì)算半數(shù)有效量,并闡述其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的發(fā)生是否與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞之間谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)有關(guān)。方法：成年雄性SD (Sprague Dawley)大鼠48只,體重180-220g,隨機(jī)分為8組(n=6),Normal組(空白組)：空白組不做任何處理；Sham組(假手術(shù)組)：分離暴露脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)后,僅穿線不結(jié)扎；SNI模型組：通過分離暴露坐骨神經(jīng)三個(gè)分支,結(jié)扎并切斷其中的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng),保留腓腸神經(jīng)完整來建立SNI模型,但不給予任何干預(yù)措施；N.S.組(生理鹽水組)：建立SNI模型成功后,鞘內(nèi)穿刺注射15μ1生理鹽水；2-AG干預(yù)1-4組：在建立SNI模型成功后,分別鞘內(nèi)注射 2-AG 50nmol、100nmol、200nmol、400nmol。于手術(shù)前1日(BL, base line),手術(shù)后1周(1week)及鞘內(nèi)給藥后15、30、45、60分鐘測(cè)定大鼠機(jī)械爪縮閾值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)。在最后一次行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,立即迅速處死大鼠并取脊髓標(biāo)本,進(jìn)行形態(tài)學(xué)及Western-Blot檢測(cè)。采用免疫熒光雙標(biāo)記法觀察Normal組大鼠、SNI模型組大鼠及SNI神經(jīng)病理痛模型2-AG干預(yù)后,內(nèi)源性大麻素受體CB1(cannabinoid receptor 1)、CB2 (cannabinoid receptor 2)在脊髓表達(dá)情況及與神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)情況；Normal組大鼠、SNI模型組大鼠及SNI模型組大鼠在2-AG干預(yù)后谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)的表達(dá)變化情況。Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大麻素受體CB1蛋白、CB2蛋白及GS蛋白表達(dá)量變化情況。結(jié)果：行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn),Normal組與Sham組在術(shù)前及術(shù)后大鼠MWT均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Normal組相比,SNI模型組大鼠MWT明顯下降(F(1,71)=3844.857,P0.001),在觀察期的(1week及15、30、45、60分鐘)時(shí)間點(diǎn)上也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；N.S.組與SNI模型組相比,大鼠MWT無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鞘內(nèi)注射不同劑量的內(nèi)源性大麻素2-AG(50,100,200,400nmol;注射劑量15μ1)后,觀察到隨著2-AG藥物濃度的增加,對(duì)SNI誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理性觸誘發(fā)痛的抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng),且成劑量依賴關(guān)系。與SNI模型組相比,2-AG400 nmol、200 nmol、100nmol、50nmol組大鼠MWT的上升均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2-AG400 nmol:F(1,71)=100.898,P0.001；2-AG 200 nmol:F(1,71)=15.207,P=0.011； 2-AG 100 nmol:F(1,71)=20.214,P=0.006；2-AG 50 nmol:F(1,71)=36.554, P=0.002).通過線性回歸統(tǒng)計(jì)分析,得出2-AG在SNI神經(jīng)病理性疼痛模型中,鎮(zhèn)痛作用的半數(shù)有效量(ED50)值為227.25nmol.形態(tài)學(xué)研究顯示,與Normal組相比,神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞在SNI模型組均不同程度的被激活；在Normal組觀察到,CB1受體在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá),SNI組的CB1受體表達(dá)明顯增強(qiáng),且主要與星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)；2-AG干預(yù)后,神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)減弱,同時(shí)CB1受體的表達(dá)亦減弱。在Normal組和SNI組均未觀察到CB2受體的表達(dá)。在Normal組觀察GS的表達(dá),發(fā)現(xiàn)呈低表達(dá)；在SNI組,GS的表達(dá)明顯增強(qiáng),主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)；2-AG干預(yù)后,明顯的抑制了GS的表達(dá)和GS與星形膠質(zhì)細(xì)胞的共表達(dá)。Western-blot檢測(cè)顯示,CB1受體在SNI組的表達(dá)明顯高于Normal組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001),2-AG的干預(yù)未能影響CB1受體的表達(dá)；CB2受體在Normal組未檢測(cè)出表達(dá),但在SNI組表達(dá)量明顯提高(P0.001),且2-AG的干預(yù)后,CB2受體蛋白的表達(dá)有所下降(P0.01)；同Normal組比較,GS蛋白在SNI組表達(dá)明顯提高(P0.001)；2-AG干預(yù)后,GS蛋白的表達(dá)明顯下降(P0.001)。結(jié)論：內(nèi)源性大麻素2-AG抑制了SNI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性觸誘發(fā)痛,該鎮(zhèn)痛效應(yīng)的機(jī)制之一可能是通過內(nèi)源性大麻素2-AG作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞上大麻素CB1受體,抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán),從而減少了神經(jīng)元突觸末梢興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放來實(shí)現(xiàn)的,但是不能排除可能通過CB2受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng),同時(shí)2-AG通過作用于神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞上的CB1受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)亦不能排除。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)源性大麻素 2-AG 神經(jīng)病理痛 星形膠質(zhì)細(xì)胞 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R402;R-332
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 引言9-17
• 1.1 神經(jīng)病理痛的產(chǎn)生、傳導(dǎo)、主要臨床表現(xiàn)及形成機(jī)制9-10
• 1.2 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與神經(jīng)病理性疼痛10-13
• 1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛中的作用13-15
• 1.4 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)在神經(jīng)病理性疼痛中的作用15-17
• 第二章 材料與方法17-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17-18
• 2.2 主要儀器設(shè)備18
• 2.3 主要藥品及試劑18-20
• 2.4 模型建立20
• 2.5 機(jī)械痛覺測(cè)定20-21
• 2.6 鞘內(nèi)注射給藥21
• 2.7 免疫熒光檢測(cè)21-22
• 2.8 Wsetern-blot檢測(cè)22
• 2.9 實(shí)驗(yàn)分組22-23
• 2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23-24
• 第三章 結(jié)果24-31
• 3.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-25
• 3.1.1 Normal組、Sham組及SNI模型組大鼠MWT變化情況24
• 3.1.2 不同劑量2-AG對(duì)SNI模型大鼠痛敏行為反應(yīng)抑制作用24
• 3.1.3 2-AG抑制SNI模型大鼠痛敏行為反應(yīng)的ED_(50)值24-25
• 3.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-29
• 3.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP與CB1受體表達(dá)及共表達(dá)情況25-26
• 3.2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物ox-42與CB1受體表達(dá)及共表達(dá)情況26-27
• 3.2.3 神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物NeuN與CB1受體表達(dá)及共表達(dá)情況27-28
• 3.2.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP與GS表達(dá)及共表達(dá)情況28-29
• 3.3 Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
• 3.3.1 CB1受體表達(dá)情況29
• 3.3.2 CB2受體表達(dá)情況29-30
• 3.3.3 GS表達(dá)情況30-31
• 第四章 討論31-35
• 第五章 創(chuàng)新點(diǎn)與局限性35-36
• 5.1 本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新點(diǎn)35
• 5.2 本實(shí)驗(yàn)局限性35-36
• 第六章 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 附錄一43-45
• 附錄二45-46
• 在學(xué)期間的研究成果46-47
• 致謝47

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