本文關(guān)鍵詞：鮑曼不動桿菌外膜蛋白W在臨床分離株中的表達(dá)及其致病性研究

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【摘要】：目的:以鮑曼不動桿菌臨床分離株為研究對象,研究外膜蛋白W(OmpW)在不同臨床分離株中的表達(dá)是否存在差異;同步克隆表達(dá)重組蛋白OmpW并對其體外致病特征進(jìn)行初步研究,為進(jìn)一步闡明多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制和尋找抗感染靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和思路。方法:1.人工合成多肽抗原,通過動物免疫得到抗血清,獲取抗Omp W蛋白多克隆抗體,鑒定后純化該多克隆抗體。2.選取臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌31株(耐藥組)及碳青霉烯類抗生素敏感株30株(敏感組),通過蛋白印跡法(Western Blot)檢測2組分離株中OmpW蛋白表達(dá)情況。3.以鮑曼不動桿菌臨床株A1和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606為模板,通過PCR方法擴(kuò)增ompW和ompA基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體,經(jīng)測序驗(yàn)證后,篩選陽性克隆表達(dá)重組蛋白OmpW和OmpA進(jìn)行蛋白純化。4.重組蛋白OmpW和OmpA分別與人喉癌細(xì)胞株Hep-2進(jìn)行培養(yǎng),同步采用JC-1和DAPI熒光染料檢測Hep-2細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:1.人工偶聯(lián)多肽的藍(lán)色載體構(gòu)建成功,經(jīng)臨床分離鮑曼不動桿菌菌體蛋白驗(yàn)證,在抗血清中得到抗OmpW蛋白的多克隆抗體。2.經(jīng)過Western Blot檢測,鮑曼不動桿菌耐藥組Omp W蛋白表達(dá)陽性率100%,敏感組的OmpW蛋白表達(dá)陽性率63.33%,耐藥組和敏感組OmpW蛋白表達(dá)量分布存在顯著差異,經(jīng)過Fisher確切概率法檢驗(yàn),χ2=12.359,P=0.0000.01,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體,經(jīng)過基因測序驗(yàn)證,在原核表達(dá)系統(tǒng)(pET30a/ompW、pET30a/ompA)中高表達(dá),基因分子量分別為987bp和966bp,大小與預(yù)期值相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)尿素和Tris-HCl處理純化,得到高純度的重組蛋白OmpW和OmpA,分子量分別為42kD和41kD。4.在Hep-2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中,外膜蛋白OmpW和OmpA與細(xì)胞作用后,JC-1染料檢測綠色熒光明顯增多,提示兩種蛋白都有誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡作用,DAPI染料檢測藍(lán)色熒光明顯增多,提示兩種蛋白都可以導(dǎo)致Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論:1.鮑曼不動桿菌碳青霉烯類耐藥株OmpW蛋白表達(dá)量明顯高于敏感株。2.外膜蛋白OmpW可體外誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋亡,提示OmpW通過特定途徑參與多重耐藥鮑曼不動桿菌致病過程,但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：鮑曼不動桿菌 致病性 外膜蛋白W
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• 英文摘要5-7
• 前言7-8
• 材料與方法8-16
• 結(jié)果16-24
• 討論24-26
• 參考文獻(xiàn)26-31
• 文獻(xiàn)綜述31-45
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 縮略語表45-46
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況46-47
• 個人簡歷47-48
• 致謝48

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本文編號：622517