本文關(guān)鍵詞：遲鈍愛德華氏菌生物被膜狀態(tài)下耐藥相關(guān)基因與蛋白的研究

  更多相關(guān)文章： 生物被膜 遲鈍愛德華氏菌 蛋白質(zhì)組學 基因組學 耐藥性

【摘要】：抗生素的發(fā)現(xiàn)使很多細菌感染性疾病得以控制,但是,隨著抗生素的廣泛使用,尤其是濫用和誤用,導致大量的耐藥菌株出現(xiàn),甚至出現(xiàn)了多重耐藥菌株和超級耐藥菌株。此外,無論是臨床上還是養(yǎng)殖業(yè),很多細菌生物被膜的形成更是加劇了耐藥性的嚴重性。因此,闡明細菌生物被膜的耐藥機制對解決耐藥性具有重大意義。一直以來,遲鈍愛德華氏菌是魚類一種重要的致病菌,該菌生物被膜的形成造成魚類慢性感染并引起巨大的經(jīng)濟損失,并且抗生素的長期使用導致其非常嚴重的耐藥性,因此應對和解決遲鈍愛德華氏菌的耐藥性問題已刻不容緩。因此研究遲鈍愛德華氏菌生物被膜狀態(tài)下的耐藥機制具有重要的理論意義和應用前景。本論文利用蛋白質(zhì)組學與基因組學相關(guān)研究技術(shù),分析遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda ATCC15947)生物被膜狀態(tài)下適應性耐藥和獲得性耐藥過程中蛋白質(zhì)的變化進行,并且比較抗生素敏感株和土霉素傳代耐藥菌株的全基因組特征,探討遲鈍愛德華氏菌生物被膜下的耐藥相關(guān)蛋白與基因。本研究首先采用iTRAQ標記的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù),對生物被膜狀態(tài)下遲鈍愛德華氏菌土霉素耐藥菌株(獲得性耐藥)和抗生素敏感菌株(對照)在土霉素脅迫下(適應性耐藥)蛋白質(zhì)組的變化進行分析。結(jié)果表明,在生物被膜狀態(tài)下,適應性耐藥共有281個蛋白發(fā)生差異表達,其中有193個下調(diào)表達,88個上調(diào)表達；獲得性耐藥中,共有70個蛋白變化,包括20個下調(diào)表達和50個上調(diào)表達。隨后的生物信息學分析發(fā)現(xiàn),在適應性耐藥中多個外膜蛋白(OppA、 MalE、GlnH等)的表達下調(diào),核糖體相關(guān)蛋白的表達上調(diào),而與糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和TCA循環(huán)等產(chǎn)能代謝途徑相關(guān)蛋白表達下調(diào)；在獲得性耐藥中,多個ATP依賴型轉(zhuǎn)運蛋白(NikA、OppA、MalE等)的表達發(fā)生下降,RNA聚合酶相關(guān)蛋白表達上升。KEGG分析發(fā)現(xiàn),細菌趨化作用減弱,RNA聚合酶活性增加,進而使翻譯途徑增強。本研究中利用q-PCR和Western blotting技術(shù)對差異蛋白中的部分差異蛋白進行進一步的驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),核糖體、代謝途徑相關(guān)酶以及ABC轉(zhuǎn)運等相關(guān)基因相應的mRNA水平上的變化基本與蛋白質(zhì)水平上一致；Western blotting分析表明PflB和PspB蛋白在生物被膜耐藥中確實發(fā)生了變化,可能是生物被膜耐藥相關(guān)蛋白。此外,由于在兩種耐藥行為中,細菌能量代謝途徑都呈現(xiàn)下降趨勢,因此對產(chǎn)能關(guān)鍵途徑TCA循環(huán)中的兩種重要酶進行了活性測定。測定結(jié)果顯示,生物被膜耐藥過程中琥珀酸脫氫酶(SDH)和α-酮戊二酸脫氫酶(a-KGDH)的活性的確都明顯下降,提示細菌可能通過下調(diào)胞內(nèi)的能量代謝介導生物被膜耐藥。此外,為了研究基因突變對細菌耐藥的影響,本論文利用全基因組測序技術(shù)對土霉素耐藥菌株和敏感菌株的基因組進行了重測序。分析比較結(jié)果表明,38個已知的基因,如pgm、ppsA、gplK、tolC等發(fā)生了突變,這些基因的位點突變可能參與了細菌耐藥的過程。此外,還有8個蛋白在獲得性耐藥中表達水平發(fā)生變化,同時基因上也發(fā)生了突變(fliC, parB, accA等),提示這些基因的突變與獲得性耐藥可能有一定關(guān)系。綜述所述,生物被膜狀態(tài)下,遲鈍愛德華氏菌可能通過以下方式介導細菌產(chǎn)生耐藥：(1)一些外膜蛋白(OppA、MalE、GlnH等)的下調(diào)表達,降低細胞膜的通透性；(2)降低TCA循環(huán)等能量代謝途徑；(3)增強翻譯途徑；(4)下調(diào)細菌的趨化作用：(5)一些酶和外膜蛋白相關(guān)基因的突變。這些耐藥機制的發(fā)現(xiàn),為解決生物被膜的耐藥性提供新思路和有效候選靶標位點,對生物被膜感染性疾病的治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：生物被膜 遲鈍愛德華氏菌 蛋白質(zhì)組學 基因組學 耐藥性
【學位授予單位】：福建農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446.5
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 前言13-28
• 1. 抗生素耐藥性13-15
• 1.1 抗生素的作用機制13-14
• 1.2 抗生素的耐藥性14
• 1.3 四環(huán)素類抗生素的耐藥性14-15
• 2. 細菌耐藥性的研究進展15-20
• 2.1 國內(nèi)外細菌耐藥性的現(xiàn)狀15-16
• 2.2 細菌耐藥性的危害16-17
• 2.3 細菌的耐藥機制17-19
• 2.4 細菌耐藥的控制策略19-20
• 3. 細菌生物被膜耐藥性研究進展20-25
• 3.1 細菌生物被膜的形成、結(jié)構(gòu)和功能20-21
• 3.2 生物被膜相關(guān)感染及防治措施21-23
• 3.3 細菌生物被膜的耐藥機制23-24
• 3.4 生物被膜在遲鈍愛德華氏菌中的研究24-25
• 4. 遲鈍愛德華氏菌及其致病機理25-26
• 4.1 遲鈍愛德華氏菌簡介25
• 4.2 遲鈍愛德華氏菌的致病機制25-26
• 4.3 遲鈍愛德華氏菌感染魚類的防治26
• 5. 本論文主要研究內(nèi)容及意義26-28
• 第二章 材料與方法28-46
• 1. 材料28-32
• 1.1 生物材料28
• 1.2 實驗試劑、材料及來源28-29
• 1.3 儀器設備29-30
• 1.4 常用試劑配制30-32
• 2. 實驗方法32-46
• 2.1 遲鈍愛德華菌MIC的測定32
• 2.2 遲鈍愛德華氏菌耐藥菌株的篩選口32-33
• 2.3 生物被膜狀態(tài)下遲鈍愛德華菌生長曲線的測定33
• 2.4 生物被膜狀態(tài)下遲鈍愛德華菌全蛋白的分離純化33
• 2.5 蛋白酶解及肽段iTRAQ標記33-34
• 2.6 LC MS/MS鑒定34
• 2.7 生物信息學分析34-35
• 2.8 遲鈍愛德華氏菌基因組總DNA的提取35
• 2.9 PCR擴增反應體系及條件35-36
• 2.10 質(zhì)粒的提取36-37
• 2.11 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收與純化37
• 2.12 目的基因表達載體的構(gòu)建37-38
• 2.13 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化38
• 2.14 小量誘導驗證38
• 2.15 包涵體蛋白的制備與純化38-39
• 2.16 鼠抗血清的制備39
• 2.17 酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測鼠抗血清效價39-40
• 2.18 Western blotting40
• 2.19 生物被膜狀態(tài)下遲鈍愛德華氏菌總RNA提取40-41
• 2.20 RNA反轉(zhuǎn)錄41-42
• 2.21 q-PCR反應體積及條件42-43
• 2.22 α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)活性的測定43
• 2.23 琥珀酸脫氫酶(Succinate Dehydrogenase,SDH)活性的測定43-44
• 2.24 全基因組重測序方法44-45
• 2.25 重測序序列的生物信息學分析45-46
• 第三章 生物被膜耐藥蛋白組學的研究46-82
• 第一節(jié) 生物被膜狀態(tài)下適應性耐藥的蛋白質(zhì)組學研究46-58
• 1. 引言46
• 2. 結(jié)果46-56
• 2.1 土霉素對遲鈍愛德華氏菌的MIC值46-47
• 2.2 測定遲鈍愛德華氏菌生物被膜的生長曲線47
• 2.3 生物被膜全蛋白的提取47-48
• 2.4 LC MS/MS分析48-51
• 2.5 相關(guān)性分析51
• 2.6 適應性耐藥差異蛋白生物信息學分析51-56
• 3. 討論56-57
• 4. 小結(jié)57-58
• 第二節(jié) 生物被膜狀態(tài)下獲得性耐藥的蛋白質(zhì)組學研究58-71
• 1. 引言58
• 2. 結(jié)果58-69
• 2.1 遲鈍愛德華氏菌耐藥菌株的篩選58-59
• 2.2 耐藥菌株生物被膜生長曲線以及全蛋白的提取59-60
• 2.3 LC MS/MS分析60-65
• 2.4 相關(guān)性分析65
• 2.5 獲得性耐藥差異蛋白生物信息學分析65-69
• 3. 討論69-70
• 4. 小結(jié)70-71
• 第三節(jié) 遲鈍愛德華菌生物被膜耐藥差異蛋白的驗證71-82
• 1. 引言71-72
• 2. 結(jié)果72-80
• 2.1 q-PCR驗證72-73
• 2.2 PflB和PspB抗體制備73-77
• 2.3 Western blotting分析77-78
• 2.4 琥珀酸脫氫酶(SDH)和α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)活性的測定78-80
• 3. 討論80-82
• 第四章 遲鈍愛德華氏菌耐藥菌株基因組重測序及耐藥基因篩選82-93
• 1. 引言82-83
• 2. 結(jié)果83-91
• 2.1 數(shù)據(jù)概況83-85
• 2.2 參考基因組比對結(jié)果85
• 2.3 SNP檢測及統(tǒng)計85-86
• 2.4 InDel檢測及統(tǒng)計86
• 2.5 耐藥菌株中的SNP和InDel位點分析86-87
• 2.6 突變基因在蛋白水平上的變化87-91
• 3. 討論91-92
• 4. 小結(jié)92-93
• 總結(jié)與展望93-95
• 參考文獻95-106
• 附錄106-107
• 致謝107-108
• 碩士研究生期間發(fā)表的論文108

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