本文關(guān)鍵詞：肺炎克雷伯菌CS309耐藥基因檢測和NDM-1基因的克隆及原核表達

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【摘要】：目的檢測產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌CS309是否同時攜帶產(chǎn)IMP、VIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶的耐藥基因,同時構(gòu)建NDM-1基因原核表達質(zhì)粒,并在大腸埃希菌中進行表達。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增IMP、VIM和KPC耐藥基因;以產(chǎn)NDM-1肺炎克雷伯菌CS309為DNA模板,PCR擴增NDM-1全長,并將其與pGEM-T克隆載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α,繼而對陽性克隆進行雙酶切,將酶切片段與pET-28α(+)表達載體連接,并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21,再用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白表達,并采用SDS-PAGE和Western blot技術(shù)驗證NDM-1蛋白。結(jié)果經(jīng)PCR和測序證實,該菌同時攜帶NDM-1和IMP-4兩種金屬酶基因,未擴增出VIM、KPC耐藥基因。經(jīng)雙酶切和測序證實,原核表達質(zhì)粒pET-28α(+)-NDM-1構(gòu)建成功。SDS-PAGE發(fā)現(xiàn),重組菌株經(jīng)誘導后在28 kDa附近有明顯條帶,與預期蛋白大小27.9 kDa一致。Western blot表明誘導產(chǎn)生的融合蛋白可與NDM-1抗體特異性結(jié)合。結(jié)論肺炎克雷伯菌CS309同時攜帶NDM-1和IMP-4兩種金屬酶基因;成功構(gòu)建了NDM-1基因的原核表達質(zhì)粒,該質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21中高效融合表達。
【作者單位】： 長沙市第一醫(yī)院檢驗科;中南大學湘雅醫(yī)院檢驗科;
【關(guān)鍵詞】： 新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶型 肺炎克雷伯菌 克隆 融合蛋白
【基金】：湖南省發(fā)改委(湘發(fā)改高技[2012]1493號);湖南省發(fā)改委(湘發(fā)改投資[2014]658號) 湖南省自然科學基金(14JJ7003)
【分類號】：R440
【正文快照】： 產(chǎn)新德里金屬|(zhì)3-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-13-lactamase 1,NDM-1)菌株對抗菌藥物有極高的耐藥性,可水解碳青霉烯類等所有|3_內(nèi)酰胺類抗菌藥物。如今國內(nèi)外已不僅局限于輸人性感染[1],產(chǎn)NDM-1菌株所引發(fā)患者院內(nèi)感染的報道不斷增多[2],給臨床抗感染治療和院感控制帶來極大的

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本文編號：569872