本文關(guān)鍵詞：酸敏感性原酸酯鍵交聯(lián)低分子量聚乙烯亞胺作為基因載體的制備及表征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因治療作為當(dāng)今生物治療的重要組成部分,已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)治療方法相比,基因治療從根源上修正了引起疾病的異常基因,并且能選擇性地治療多種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。然而安全、高效、靶向表達(dá)的基因載體是基因治療成功的關(guān)鍵。在基因治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中,經(jīng)常使用的傳遞載體包括病毒載體(Viral vector)和非病毒載體(Non-viral vector)兩類,其中,陽(yáng)離子聚合物載體由于具有設(shè)計(jì)靈活、易于大規(guī)模生、低毒性、目的基因攜帶量大、基因尺寸不受限制且費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn),近年來受到研究者極大的關(guān)注。而在眾多合成材料中,聚乙烯亞胺(Polyethylenimine, PEI)由于具備較高的電荷密度以及良好的質(zhì)子緩沖能力已成為陽(yáng)離子聚合物基因載體中的研究熱點(diǎn)之一。其中,枝化PEI (25kDa)被稱為高分子基因載體領(lǐng)域的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。盡管高分子量PEI轉(zhuǎn)染效率較高,但因?yàn)槠浼?xì)胞毒性較大、不可生物降解等問題制約了PEI在臨床治療方面的應(yīng)用。為了獲得細(xì)胞毒性較低且轉(zhuǎn)染性能優(yōu)良的PEI載體,研究者們嘗試了許多方法,近些年來,通過可降解鍵交聯(lián)低分子量PEI獲得性能優(yōu)越的基因載體得到科學(xué)工作者們的持續(xù)關(guān)注。本論文通過一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的合成工藝制備了一種具有酸敏感性的丙烯酸類原酸酯單體(OEAc),之后通過控制投料比(1：1,1.75：1,3.5：1)與低分子量PEI (600 Da)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),合成了一系列主鏈含原酸酯的新型酸敏感型基因治療載體(POEI 1、POEI 2、POEI 3)。并且采用多種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)聚合物進(jìn)行了表征并研究了它們的理化性質(zhì),核磁結(jié)果分析證明OEAc以及聚合物結(jié)構(gòu)正確；凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)定了聚合物數(shù)均分子量及分子量分布；通過測(cè)定聚合物伯胺含量證明了邁克爾加成反應(yīng)的有效性,并且POEI 1的伯胺含量最高；酸堿滴定結(jié)果表明,POEI 1-3與25 kDa PEI相比具有更強(qiáng)的質(zhì)子緩沖能力,且緩沖能力隨著投料比的增加而增大,其中POEI 3的緩沖能力最強(qiáng)。原酸酯鍵具有高度酸敏感性,在酸性條件下能快速水解,因此聚合物主鏈酸響應(yīng)性由1HNMR測(cè)定,結(jié)果顯示POEI 1-3均具有較強(qiáng)的酸敏感性,三種聚合物主鏈原酸酯在pH=5.0環(huán)境下4小時(shí)內(nèi)即完全降解,核磁分析其降解機(jī)制屬于環(huán)外降解機(jī)制。在正常生理?xiàng)l件下,POEIs與質(zhì)粒DNA通過靜電作用相互結(jié)合,并有效壓縮DNA形成復(fù)合物納米粒子。通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以及肝素置換實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)聚合物DNA壓縮及保護(hù)能力的強(qiáng)弱,結(jié)果表明,POEI 1-3均能有效壓縮質(zhì)粒DNA,并且DNA壓縮能力與聚合反應(yīng)投料比例有關(guān),反應(yīng)比例越大壓縮能力越差,同時(shí)采用DNase Ⅰ降解實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了POEI 1和POEI 2能夠保護(hù)DNA免受DNase Ⅰ的酶解。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)結(jié)果顯示POEI 1和POEI 2與DNA在質(zhì)量比為2-32條件下能有效包裹質(zhì)粒DNA形成粒徑為200～300 nm、表面帶有正電荷的納米復(fù)合物顆粒,適合介導(dǎo)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞；同時(shí)由DLS分析驗(yàn)證了POEI/DNA復(fù)合物同樣表現(xiàn)出良好的酸敏感性,在pH=5.0條件下,三種復(fù)合物粒徑均發(fā)生不同程度的增大,表明復(fù)合物穩(wěn)定性減弱,進(jìn)而有利于DNA釋放。此外,以25kDa PEI為對(duì)照物,通過一系列測(cè)試探討了POEI作為基因載體的潛力和性能。本工作采用體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT法)評(píng)價(jià)了POEI 1-3的生物相容性,與PEI (25 KD a)相比,三種聚合物(POEIs)與293T、SH-SY5Y、及HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)均表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性,其中POEI 3在高濃度下(100μg/mL)與三種細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞成活率也均超過80%。本文還通過流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定法和熒光顯微鏡直接觀察法進(jìn)行體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率檢測(cè),結(jié)果顯示,POEI 1 和 POEI2對(duì)于293T細(xì)胞系具有一定的轉(zhuǎn)染性能,POEI 1與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為4時(shí)在293T細(xì)胞系中染效率最高達(dá)到7.63%。此外,在SH-SY5Y細(xì)胞系中,POEI 1和POEI 2的基因復(fù)合物在質(zhì)量比為8時(shí)具有最佳轉(zhuǎn)染效率,分別是25 kDa PEI的2.42倍和1.15倍,轉(zhuǎn)染性能均優(yōu)于25 kDa PEI, 而 POEI 3 在這兩種細(xì)胞系中幾乎沒有轉(zhuǎn)染性能。綜上所述,這種基于低分子量PEI的pH敏感型基因載體(POEI 1口POEI2)在提高基因轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)降低了其細(xì)胞毒性、提高了生物相容性,再加上其優(yōu)良的DNA結(jié)合能力,因此在基因治療領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：基因治療 原酸酯 聚乙烯亞胺 邁克爾加成
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R450;Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 緒論11-20
• 1.1 基因治療概述11-12
• 1.2 非病毒基因載體(Non-viral Vector)12-14
• 1.2.1 陽(yáng)離子聚合物(Cationic Polymer)12
• 1.2.2 常見的陽(yáng)離子聚合物基因載體12-13
• 1.2.3 陽(yáng)離子聚合物載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的一般過程13-14
• 1.3 聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)14-17
• 1.3.1 高分子量PEI的修飾與改性15-16
• 1.3.2 低分子量PEI的修飾與改性16-17
• 1.4 含原酸酯的陽(yáng)離子聚合物基因載體17
• 1.5 選題思路及研究?jī)?nèi)容17-20
• 第二章 基于原酸酯交聯(lián)的低分子量PEI基因載體(POEI)20-37
• 2.1 引言20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器21-23
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 2.3.1 丙烯酸類原酸酯單體(OEAc)的合成23-25
• 2.3.2 聚合物POEI的合成25
• 2.4 合成產(chǎn)物的表征25-28
• 2.4.1 結(jié)構(gòu)表征25-26
• 2.4.2 POEI的伯胺含量測(cè)定26
• 2.4.3 POEI質(zhì)子緩沖能力的測(cè)定26
• 2.4.4 POEI的酸敏感性檢測(cè)26-28
• 2.5 結(jié)果與討論28-35
• 2.5.1 二羥基原酸酯單體(OEDg)的核磁共振譜圖分析28-29
• 2.5.2 丙烯酸類原酸酯單體(OEAc)的核磁共振譜圖分析29-30
• 2.5.3 聚合物POEI的表征30-35
• 2.6 本章小結(jié)35-37
• 第三章 POEI/DNA復(fù)合物的制備及表征37-51
• 3.1 引言37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器37-39
• 3.2.1 菌種與報(bào)告基因37
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑37-38
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器38-39
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 3.3.1 菌種培養(yǎng)與無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取39-40
• 3.3.2 pEGFP-N1質(zhì)粒的純度及濃度測(cè)定40-41
• 3.3.3 聚合物POEI/DNA復(fù)合物的制備41
• 3.3.4 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)41-42
• 3.3.5 肝素置換實(shí)驗(yàn)42
• 3.3.6 DNase Ⅰ酶降解實(shí)驗(yàn)42
• 3.3.7 POEI/DNA復(fù)合物的粒徑以及Zeta電位測(cè)定42-43
• 3.3.8 POEI/DNA復(fù)合物酸敏感性分析43
• 3.4 結(jié)果與討論43-50
• 3.4.1 凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)43-45
• 3.4.2 肝素置換實(shí)驗(yàn)45
• 3.4.3 DNase Ⅰ酶降解實(shí)驗(yàn)45-47
• 3.4.4 POEI/DNA復(fù)合物的粒徑與Zeta電位47-48
• 3.4.5 POEI/DNA復(fù)合物的酸敏感性實(shí)驗(yàn)48-50
• 3.5 本章小結(jié)50-51
• 第四章 POEI的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)及其介導(dǎo)的體外基因轉(zhuǎn)染研究51-62
• 4.1 引言51
• 4.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器51-53
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑51-52
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器52-53
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法53-56
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)53-54
• 4.3.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)54-55
• 4.3.3 聚合物介導(dǎo)DNA的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)55-56
• 4.4 結(jié)果與討論56-61
• 4.4.1 POEI的細(xì)胞毒性56-57
• 4.4.2 POEI介導(dǎo)的體外基因轉(zhuǎn)染57-61
• 4.5 本章小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄72

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1 林霞;何曉曉;王柯敏;譚蔚泓;;一種基于二氧化硅微顆粒的基因載體的制備新方法[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2006年05期

2 李瀟;金屬納米棒用作基因治療中的基因載體[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2004年02期

3 李凌衡;趙壽元;;哺乳動(dòng)物基因載體的研究進(jìn)展[J];自然雜志;1988年02期

4 要e，

本文編號(hào)：475909