本文關鍵詞：新德里金屬-β-內酰胺酶的檢測方法建立及應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]利用新德里金屬-β-內酰胺酶(New Dehli Metallo-β-lactamase 1, NDM-1)的原核表達載體誘導表達NDM-1與6×His標簽的融合蛋白,通過親和層析法純化NDM-1蛋白,采用體內培養(yǎng)法,能將穩(wěn)定分泌抗NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株3F8接種于BALB/c小鼠腹腔,制備鼠抗NDM-1單克隆抗體；以單克隆抗體和膠體金標記技術為基礎,根據競爭抑制原理,建立NDM-1的斑點金免疫滲濾檢測方法,并應用于細菌培養(yǎng)物中NDM-1的檢測。[方法]1.采用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導攜帶NDM-1的原核表達載體的宿主菌表達NDM-1-6×His的融合蛋白,以SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的分子量,將重組基因工程菌擴大培養(yǎng)并誘導表達,最后采用親和層析法純化誘導的目的蛋白,并研究它的酶促動力學特征。2.抗NDM-1單克隆抗體的制備與純化采用體內培養(yǎng)法,將能夠穩(wěn)定分泌抗NDM-1單克隆抗體的雜交瘤細胞株3F8接種于BALB/c小鼠腹腔,每只BALB/c小鼠接種106個雜交瘤細胞,共接種6只,獲得含有抗體的腹水36m1。通過親和層析法純化,5 ml親和層析柱,每次可獲得4.50 mg高純度的抗NDM-1單克隆抗體。采用ELISA法分析抗體免疫活性。3.膠體金及免疫金探針的制備采用檸檬酸三鈉還原法,成功制備20 nm膠體金溶膠；此基礎上建立抗NDM-1單克隆抗體的膠體金標記條件：最佳標記pH值為7.4,最佳標記量為8μg抗NDM-1單克隆抗體/ml膠體金。采用ELISA方法分析了免疫金探針活性。[結果]1.表達并純化獲得具酶活性的NDM-1-6×His融合蛋白,經酶促動力學實驗證明純化的融合蛋白具有較高的酶活性。2.NDM-1斑點金免疫滲濾檢測方法的建立根據競爭抑制原理,以金標抗NDM-1單克隆抗體作為分析探針,NDM-1完全抗原NDM-1偶聯物作為包被抗原,羊抗鼠IgG為質控點,初步建立了NDM-1的斑點金免疫滲濾檢測體系(dot immunogold assay, DIGA)。當包被抗原濃度為6ng/ml,免疫金探針為原液時,肉眼判定NDM-1陽性,檢測限為6ng/ml,檢測時間為10 min左右.[結論]本研究獲得了高效的重組基因工程大腸桿菌表達菌株,制備鼠抗NDM-1單克隆抗體；以單克隆抗體和膠體金標記技術為基礎,根據競爭抑制原理,建立了NDM-1的斑點金免疫滲濾檢測方法,并將其初步應用于細菌培養(yǎng)物中NDM-1的檢測。
【關鍵詞】：新德里金屬-β-內酰胺酶1 原核表達 單克隆抗體 斑點金免疫
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R446
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符號說明10-11
• 前言11-14
• 一、研究背景11-13
• 二、研究目的13-14
• 材料與方法14-32
• 一、材料14-21
• 二、方法21-32
• 結果32-43
• 一、NDM-1蛋白的純化及鑒定32-37
• 二、抗NDM-1單克隆抗體的制備及鑒定37
• 三、NDM-1斑點金免疫滲濾檢測方法的建立37-43
• 討論43-47
• 一、NDM-1蛋白的鑒定分析43
• 二、抗NDM-1單克隆抗體的制備及鑒定分析43-44
• 三、NDM-1斑點金免疫滲濾檢測方法的應用分析44-47
• 小結47-48
• 創(chuàng)新與不足之處48-49
• 參考文獻49-55
• 文獻綜述55-64
• 參考文獻61-64
• 致謝64-65
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文目錄65-66
• 學位論文評閱及答辯情況表66

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