本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:布魯氏菌病作為一種人畜共患病,嚴(yán)重威脅著環(huán)境及人類身體健康,建立一種快速、可靠的布魯氏菌檢測(cè)方法,對(duì)其預(yù)防及診斷都具有重要意義。而熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是一種公認(rèn)的簡(jiǎn)單、靈敏、快速的檢測(cè)方法。但是,在諸多布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道中,人們沒有意識(shí)到抑制物的存在將影響本方法用于樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性及可靠性。因此本文建立了一種含兩種內(nèi)參基因的布魯氏菌熒光定量PCR方法,在快速、靈敏的檢測(cè)布魯氏菌的同時(shí),質(zhì)控樣品DNA及PCR檢測(cè)過程,提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確度。方法:以哺乳動(dòng)物beta-actin基因?yàn)閮?nèi)源性內(nèi)參基因,質(zhì)控樣本DNA;以重組質(zhì)粒為外源性內(nèi)參基因,質(zhì)控PCR擴(kuò)增過程。針對(duì)布魯氏菌屬特異性基因IS711,建立用于樣品檢測(cè)的布魯氏菌熒光定量PCR方法,優(yōu)化布魯氏菌引物濃度、探針及反應(yīng)溫度,并驗(yàn)證其敏感性、特異性及穩(wěn)定性,做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將該方法用于樣品檢測(cè),并與細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較。之后,將陽性樣品進(jìn)行布魯氏菌的SNP基因分型。結(jié)果:1)確立了將哺乳動(dòng)物的beta-actin基因作為內(nèi)源內(nèi)參基因,并設(shè)計(jì)出特異性引物及探針。用于質(zhì)控樣品DNA提取物;選取大西洋鮭魚β-球蛋白基因片段,建立了外源重組質(zhì)粒作為外源性內(nèi)參,用于質(zhì)控PCR擴(kuò)增。2)建立并優(yōu)化了布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法。建立布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:只擴(kuò)增布魯氏菌DNA時(shí),相關(guān)系數(shù)R2為0.999(Y=-3.34X+42.85);擴(kuò)增布魯氏菌和外源重組質(zhì)粒時(shí),相關(guān)系數(shù)R2為0.997(Y=-3.13X+40.50);同時(shí)擴(kuò)增布魯氏菌及內(nèi)外源性內(nèi)參基因時(shí),相關(guān)系數(shù)R2為0.997(Y=-3.12X+40.9)。說明加入的外源及內(nèi)源內(nèi)參基因?qū)Σ季鷻z測(cè)沒有太大影響。本檢測(cè)方法的檢測(cè)線達(dá)5.6拷貝·μL-1,在特異性檢測(cè)中,布魯氏菌引物及探針只擴(kuò)增了六種經(jīng)典布魯氏菌,對(duì)陰性參考菌均無非特異性擴(kuò)增。而且,本檢測(cè)方法穩(wěn)定性良好。3)將本方法用于樣本檢測(cè),共檢測(cè)了30份動(dòng)物組織樣品,360份動(dòng)物全血,91份奶樣,其中檢測(cè)出7份布魯氏菌陽性組織樣品,12份布魯氏菌陽性血樣及3份布魯氏菌陽性奶樣。4)查找布魯氏菌羊種3型以及布魯氏菌疫苗株A19/S19及Rev.1的SNP位點(diǎn)用于基因分型,并設(shè)計(jì)出特異性引物及探針。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立了一種可以直接應(yīng)用于樣品檢測(cè),含有兩種內(nèi)參基因的布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法,并能夠快速、靈敏、可靠的檢測(cè)出樣品中的布魯氏菌。并將陽性樣品進(jìn)行進(jìn)一步的布魯氏菌SNP基因分型。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 內(nèi)參基因 熒光定量PCR SNP基因分型
【學(xué)位授予單位】：重慶理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R440;R516.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 緒論11-23
• 1.1 布魯氏菌簡(jiǎn)介11-12
• 1.2 人患布病12-13
• 1.2.1 人間布病情況12
• 1.2.2 人患布病發(fā)病機(jī)制12-13
• 1.2.3 人患布病的防治13
• 1.3 布魯氏菌病的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法13-14
• 1.4 用于布魯氏菌檢測(cè)的PCR方法14-20
• 1.4.1 布魯氏菌DNA的提取14-15
• 1.4.2 單引物PCR技術(shù)15-16
• 1.4.3 多重PCR技術(shù)16
• 1.4.4 熒光PCR技術(shù)16-19
• 1.4.5 其他PCR方法19-20
• 1.5 內(nèi)參基因的重要性20-21
• 1.6 單核苷酸多態(tài)性（SNP）21-23
• 2 布魯氏菌熒光定量PCR方法的建立23-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用菌23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)用試劑23
• 2.1.3 試驗(yàn)用儀器23-24
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)用探針及引物24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備24-25
• 2.2.2 細(xì)菌DNA的提取25
• 2.2.3 布魯氏菌屬標(biāo)準(zhǔn)品的制備25-27
• 2.2.4 外源性內(nèi)參重組質(zhì)粒的制備27-28
• 2.2.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化28
• 2.2.6 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系的建立28
• 2.2.7 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備28-29
• 2.2.8 多重?zé)晒舛縋CR方法靈敏性、特異性及重復(fù)性檢測(cè)29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-37
• 2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備29-31
• 2.3.2 內(nèi)源性內(nèi)參基因引物特異性驗(yàn)證31-32
• 2.3.3 布魯氏菌熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化32-35
• 2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備35
• 2.3.5 靈敏性35-36
• 2.3.6 特異性36-37
• 2.3.7 重復(fù)性37
• 2.4 討論37-41
• 3 熒光定量PCR方法用于樣品檢測(cè)41-47
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)用試劑41
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)用儀器41
• 3.1.3 病料來源41-42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 3.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)42
• 3.2.2 病料DNA的提取42-43
• 3.2.3 臨床樣品的熒光定量PCR檢測(cè)43
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-45
• 3.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果43
• 3.3.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果43-45
• 3.4 討論45-47
• 4 布魯氏菌熒光定量PCR單核苷酸多態(tài)性分型方法的建立47-57
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株47
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)用試劑47
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)用儀器47-48
• 4.2 方法48-49
• 4.2.1 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的篩選48
• 4.2.2 布魯氏菌熒光定量PCR單核苷酸多態(tài)性基因48-49
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-55
• 4.3.1 布魯氏菌bp26基因序列比對(duì)49-51
• 4.3.2 引物及探針的設(shè)計(jì)51
• 4.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品建立51-52
• 4.3.4 引物溫度優(yōu)化52-53
• 4.3.5 引物及探針濃度53-54
• 4.3.6 特異性檢測(cè)54
• 4.3.7 靈敏性檢測(cè)54
• 4.3.8 重現(xiàn)性檢測(cè)54-55
• 4.4 討論55-57
• 5 結(jié)論57-59
• 5.1 總結(jié)57-58
• 5.2 展望58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及取得的研究成果66

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