發(fā)布時間：2024-04-23 02:57

　　藥物代謝相關(guān)基因SNPs的簡單、快速分型對指導(dǎo)相關(guān)藥物的個體化使用具有重要意義。本課題設(shè)計了一種等位基因特異性DNA酶自組裝(Allele specific DNAzyme assembly,ASDA)比色新方法,用于SNPs簡單、快速分型。該方法可直接使用口腔拭子樣本,免DNA提取和純化進(jìn)行SNPs基因分型檢測。本文以MTHFR C677T等位基因為模板設(shè)計了新的等位基因特異性引物,同時標(biāo)記含有G4-DNA酶的莖環(huán)結(jié)構(gòu),從而將特異性的PCR擴增子轉(zhuǎn)化為多個G4-DNA酶組裝物。通過引入額外錯配位點并進(jìn)行優(yōu)化以減少非特異性擴增。基于等位基因特異性DNA酶自主裝策略,該方法能從低至200個細(xì)胞樣本中直接鑒定MTHFR C677T等位基因型,顯示了較高的靈敏度和優(yōu)異的選擇性。可在90分鐘內(nèi)直接檢測出口腔咽拭子樣本的基因型,具有良好的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和實用性。本文建立的等位基因特異性DNA酶自組裝比色新方法為臨床實驗室提供了一個實用的平臺用于簡單、快速SNPs基因分型,并且為發(fā)展中國家促進(jìn)個體化用藥的廣泛應(yīng)用提供潛在的檢測工具。

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1等位基因特異性DNA酶自組裝SNPs分型新方法實驗原理

3結(jié)果和討論3.1方法原理及設(shè)計策略基于等位基因特異性DNA酶自組裝SNPs分型新方法的實驗原理如圖1所示，DNA釋放、DNA擴增、SNPs識別和信號輸出都在一個PCR管中完成�？谇皇米又械纳掀ぜ�(xì)胞基因組DNA在變性階段釋放并直接由KODFXDNA聚合酶擴增[1....

圖2瓊脂糖凝膠電泳表征圖：（A）AS引物3’末端倒數(shù)第3個堿基引入不同錯配的特異性驗證，（B）50ng基因組DNA，2μL全血，1.4×104白細(xì)胞及口腔細(xì)胞的AS-PCR產(chǎn)物

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文，反之亦然[36]。臨床實際樣本中含有許多抑制劑，如血紅蛋白、IgG、乳鐵都可顯著降低大多數(shù)DNA聚合酶的活性。因此，對未經(jīng)樣本直接進(jìn)行PCR擴增時必須選擇能夠抵抗這些抑制劑已知型別的MTHFR677等位基因?qū)嶋H樣本驗證了KODF性....

圖3G4-AS引物在退火溫度為68°C時擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

MTHFR677等位基因型進(jìn)行準(zhǔn)確增子與Hemin結(jié)合催化ABTS2-/，WP反應(yīng)管中野生型（677CC）而MP反應(yīng)管在該處幾乎沒有吸收MP反應(yīng)管中出現(xiàn)明顯的吸收峰（圖管在418nm處都出現(xiàn)明顯的吸收峰的比色方法可以準(zhǔn)確地對口腔拭子的插圖為相應(yīng)的比色結(jié)果，....

圖4（A）G4-AS引物用于直接擴增口腔拭子上皮細(xì)胞的瓊脂糖凝膠電泳圖；基于ASDA的比色分析方法的UV-vis吸收光譜和可視化照片（插圖）：（B）野生型模板；（C）雜合突變型

AS引物用于直接擴增口腔拭子上皮細(xì)胞的瓊脂糖凝膠電泳圖；基UV-vis吸收光譜和可視化照片（插圖）：（B）野生型模板；（C）突變型模板；該實驗的標(biāo)本為口腔拭子，WP反應(yīng)管為（a）和M（b）。（E）MTHFR677三種型別的SangerDNA測序結(jié)果hegel....

本文編號：3962512