藥物代謝相關(guān)基因SNPs的簡單、快速分型對指導相關(guān)藥物的個體化使用具有重要意義。本課題設計了一種等位基因特異性DNA酶自組裝(Allele specific DNAzyme assembly,ASDA)比色新方法,用于SNPs簡單、快速分型。該方法可直接使用口腔拭子樣本,免DNA提取和純化進行SNPs基因分型檢測。本文以MTHFR C677T等位基因為模板設計了新的等位基因特異性引物,同時標記含有G4-DNA酶的莖環(huán)結(jié)構(gòu),從而將特異性的PCR擴增子轉(zhuǎn)化為多個G4-DNA酶組裝物。通過引入額外錯配位點并進行優(yōu)化以減少非特異性擴增�；诘任换蛱禺愋訢NA酶自主裝策略,該方法能從低至200個細胞樣本中直接鑒定MTHFR C677T等位基因型,顯示了較高的靈敏度和優(yōu)異的選擇性�？稍�90分鐘內(nèi)直接檢測出口腔咽拭子樣本的基因型,具有良好的準確性、穩(wěn)定性和實用性。本文建立的等位基因特異性DNA酶自組裝比色新方法為臨床實驗室提供了一個實用的平臺用于簡單、快速SNPs基因分型,并且為發(fā)展中國家促進個體化用藥的廣泛應用提供潛在的檢測工具。

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1等位基因特異性DNA酶自組裝SNPs分型新方法實驗原理

3結(jié)果和討論3.1方法原理及設計策略基于等位基因特異性DNA酶自組裝SNPs分型新方法的實驗原理如圖1所示，DNA釋放、DNA擴增、SNPs識別和信號輸出都在一個PCR管中完成�？谇皇米又械纳掀ぜ毎蚪MDNA在變性階段釋放并直接由KODFXDNA聚合酶擴增[1....

圖2瓊脂糖凝膠電泳表征圖：（A）AS引物3’末端倒數(shù)第3個堿基引入不同錯配的特異性驗證，（B）50ng基因組DNA，2μL全血，1.4×104白細胞及口腔細胞的AS-PCR產(chǎn)物

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文，反之亦然[36]。臨床實際樣本中含有許多抑制劑，如血紅蛋白、IgG、乳鐵都可顯著降低大多數(shù)DNA聚合酶的活性。因此，對未經(jīng)樣本直接進行PCR擴增時必須選擇能夠抵抗這些抑制劑已知型別的MTHFR677等位基因?qū)嶋H樣本驗證了KODF性....

圖3G4-AS引物在退火溫度為68°C時擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

MTHFR677等位基因型進行準確增子與Hemin結(jié)合催化ABTS2-/，WP反應管中野生型（677CC）而MP反應管在該處幾乎沒有吸收MP反應管中出現(xiàn)明顯的吸收峰（圖管在418nm處都出現(xiàn)明顯的吸收峰的比色方法可以準確地對口腔拭子的插圖為相應的比色結(jié)果，....

圖4（A）G4-AS引物用于直接擴增口腔拭子上皮細胞的瓊脂糖凝膠電泳圖；基于ASDA的比色分析方法的UV-vis吸收光譜和可視化照片（插圖）：（B）野生型模板；（C）雜合突變型

AS引物用于直接擴增口腔拭子上皮細胞的瓊脂糖凝膠電泳圖；基UV-vis吸收光譜和可視化照片（插圖）：（B）野生型模板；（C）突變型模板；該實驗的標本為口腔拭子，WP反應管為（a）和M（b）。（E）MTHFR677三種型別的SangerDNA測序結(jié)果hegel....

本文編號：3962512