本文關(guān)鍵詞：人3型腺病毒LOOP1-6蛋白克隆表達及免疫鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的實驗技術(shù)篩選人流行性B屬3型腺病毒典型性代表株,探討其與GenBank的同源性。據(jù)檢測結(jié)果挑選代表株,構(gòu)建編碼LOOP 1-6蛋白的質(zhì)粒并在大腸桿菌BL21 (DE3)原核表達獲得純化的LOOP 1-6目的蛋白,以Weston-Blot法免疫鑒定。通過對其蛋白衣殼基因的變異變遷的探究和經(jīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒成功克隆表達及免疫鑒定LOOP 1-6目的蛋白,為臨床的相應(yīng)血清學(xué)診斷試劑盒的研發(fā)及腺病毒感染的防治提供實驗指導(dǎo)。方法1.用北京卓誠惠生生物科技有限公司生產(chǎn)的ABT9+7呼吸道病毒多重PCR快速檢測試劑,檢測臨床上呼吸道病毒感染的疑似病例的兒童咽拭子,進行病毒的初步篩查或者用歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司的呼吸道病原譜抗體IgM檢測試劑盒(間接免疫熒光法)檢測患者血清抗體水平。2.根據(jù)腺病毒Hexon的LOOP 1-6或LOOP7的基因可定型血清,設(shè)計相應(yīng)的引物,進行PCR及測序。由測序的結(jié)果,在NCBI上進行序列的Blast,判斷腺病毒的型別。3.挑取3型的腺病毒,進行腺病毒的分離與增殖。增殖完成后,提取核酸。根據(jù)GenBank中3型腺病毒的Hexon、Penton base和Fiber的基因序列設(shè)計的相應(yīng)的引物,進行PCR擴增和測序。4.用Sequencher 5.0對測序的結(jié)果進行處理,由軟件MEGA5.0對處理后序列進行基因親緣關(guān)系樹分析、氨基酸和核苷酸同源性分析。5.選取3型腺病毒Hexon基因相對保守的毒株并設(shè)計引物,用于六棱體的LOOP 1-6的克隆PCR模板�？寺�3型腺病毒Hexon基因的LOOP 1-6至載體pET-48b (+)質(zhì)粒上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和鎳離子親和層析純化,得到目的蛋白LOOP1-6。用抗6×His-tag抗體經(jīng)Weston-Blot法免疫鑒定表達的蛋白。結(jié)果1.從陜西、湖南、河北、山東、云南、甘肅和吉林共七個省的送檢標本中共檢測出腺病毒陽性的229份,其中7型腺病毒121份；3型腺病毒35份；其他型別73份。2.在親緣關(guān)系樹中,可見七個省十二五期間的HAdV3的六棱體、五棱體和纖突與世界范圍內(nèi)的流行概況大體一致。只在湖南發(fā)現(xiàn)了兩株Hexon基因的重組株,分別采自2012年和2013年。這兩株毒株與日本2011年分離到P7H3+7F3(genbank:JN860679.1)的毒株的Hexon基因的核苷酸同源性達98.3%和98.4%,氨基酸同源性達99.6%和99.6%；Penton base基因的核苷酸同源性為99.2%、99.2%,氨基酸同源性為98.7%、98.7%；Fiber基因的核苷酸同源性為63.6%、63.6%,氨基酸同源性為57.1%、57.1%(如圖8-a,b,c所示)。本實驗室將其命名為P7H3+7F7,說明了HAdV3的六棱體基因有發(fā)生組內(nèi)重組的可能性。除去這兩株,其余毒株Fiber基因的核苷酸同源性在99.7%-100%間,氨基酸同源性為100%；Hexon基因的核苷酸同源性在99.9%-100%,氨基酸同源性為99.7%-100%間；Penton base基因的核苷酸同源性在98.8%-100%,氨基酸同源性為98.3%-100%,說明中國人HAdV3的基因很保守。3.經(jīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒成功克隆表達及免疫鑒定,獲得純化的LOOP 1-6目的蛋白。結(jié)論本研究采用多重PCR和血清間接免疫熒光法成功鑒別了腺病毒陽性感染的標本,標本三代擴毒成功后,經(jīng)PCR測序等步驟初步闡明了中國七個省份十二五期間的3型腺病毒的蛋白衣殼基因比較保守的流行規(guī)律。經(jīng)構(gòu)建重組質(zhì)粒成功克隆表達及免疫鑒定,獲得純化的LOOP 1-6目的蛋白,為后期的血清分型試劑盒的進一步的研究提供了前期的實驗基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：HAdV 3 間接免疫熒光 Hexon基因 Penton base基因 Fiber基因 蛋白表達 免疫鑒定 診斷試劑盒
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R440
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 注釋說明清單15-17
• 引言17-19
• 1 人3型腺病毒的基因特征19-44
• 1.1 材料19-23
• 1.1.1 標本來源19-21
• 1.1.2 主要試劑21-22
• 1.1.3 主要儀器22
• 1.1.4 主要耗材22-23
• 1.2 方法23-32
• 1.2.1 復(fù)蘇、培養(yǎng)細胞23-24
• 1.2.2 凍存細胞24
• 1.2.3 病毒種類的初步鑒定24-28
• 1.2.4 人腺病毒熒光定量鑒定28-29
• 1.2.5 HEp-2細胞接種人腺病毒29-32
• 1.3 結(jié)果32-42
• 1.3.1 病毒種類的初步鑒定結(jié)果32-33
• 1.3.2 人腺病毒熒光定量PCR鑒定結(jié)果33-34
• 1.3.3 HEp-2細胞接種人腺病毒后的病變結(jié)果34-35
• 1.3.4 3型腺病毒Hexon、Penton base和Fiber基因的變異變遷規(guī)律的檢測結(jié)果35-42
• 1.4 分析與討論42-43
• 1.5 結(jié)論43-44
• 2 人3型腺病毒LOOP1-6蛋白克隆表達及免疫鑒定44-64
• 2.1 材料44-49
• 2.1.1 主要試劑44-45
• 2.1.2 主要儀器45
• 2.1.3 主要耗材45-46
• 2.1.4 主要試劑配方46-49
• 2.2 方法49-59
• 2.2.1 pGEM-T-HAdV3-Hexon-LOOP1-6質(zhì)粒的構(gòu)建49-53
• 2.2.2 pET-48b-HAdV 3-Hexon-LOOP1-6質(zhì)粒的構(gòu)建53-56
• 2.2.3 HAdV3-Hexon-LOOP 1-6蛋白的誘導(dǎo)表達及純化56-59
• 2.3 結(jié)果59-62
• 2.3.1 pGEM-T-HAdV 3-Hexon-LOOP1-6質(zhì)粒的構(gòu)建59-60
• 2.3.2 pET-48b-HAdV 3-Hexon-LOOP1-6質(zhì)粒的構(gòu)建60-61
• 2.3.3 HAdV 3-Hexon-LOOP1-6蛋白的誘導(dǎo)表達及純化61-62
• 2.4 討論62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-69
• 附錄A pET-48b(+)質(zhì)粒圖譜69-70
• 附錄B 重組質(zhì)粒pGEM-T-HAdV3-Hexon-LOOP1-6測序圖70-71
• 后記或致謝71-72
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果72-73

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