慢性乙型肝炎(以下簡稱乙肝)是目前最突出的全球性公共衛(wèi)生問題之一,嚴重威脅人類健康。盡管近些年乙肝疫苗的使用有效降低了乙肝的發(fā)病率,每年仍有1-3千萬人感染乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV),約有1百萬人死于HBV感染及其并發(fā)癥。為了有效地控制HBV的傳播,確保HBV感染者得到及時的治療,對HBV的高效檢測尤為重要。而針對HBV DNA的核酸檢測技術由于其具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢,已廣泛應用于乙肝的診斷、監(jiān)測、預后評價和輸血篩查等方面。然而,目前臨床上仍有部分HBV感染者體內存在現(xiàn)有方法難以檢出的低濃度HBV DNA,這不僅增加了由此引發(fā)的慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌的發(fā)病風險,還可能造成輸血以及肝移植過程中的HBV感染。此外,對乙肝病毒耐藥突變的檢測和監(jiān)測可預防由此引發(fā)的抗病毒治療失敗。但由于“準種”的存在,部分患者體內存在難以檢出的極低含量的HBV耐藥突變株,在某種情況下,如肝移植、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)合并感染等,這些未檢出的低含量HBV耐藥突變株,可能帶來嚴重的臨床后果(如HBV感染、肝衰竭等)。因此,研發(fā)一種高靈敏度...

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摘要
Abstract
前言
    一、研發(fā)針對乙肝病毒DNA的高靈敏檢測技術對乙肝的防治至關重要
        1.1 乙肝的流行概況
        1.2 高靈敏HBV DNA檢測的臨床意義
        1.3 現(xiàn)有HBV DNA檢測技術仍存在諸多不足
    二、研發(fā)針對乙肝病毒耐藥突變的早期檢測技術是實現(xiàn)精準治療的關鍵
        2.1 乙肝病毒耐藥概述
        2.2 高靈敏檢測乙肝耐藥突變的重要性
        2.3 現(xiàn)有的乙肝病毒耐藥突變檢測技術仍存在諸多不足
    三、CRISPR-Cas13a系統(tǒng)可用于核酸的高靈敏、高特異性檢測
        3.1 CRISPR-Cas13a系統(tǒng)簡介
        3.2 CRISPR-Cas13a系統(tǒng)在核酸檢測技術中的應用
        3.3 本文研究
第一章 基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的高靈敏度HBV DNA檢測方法的建立
    1.1 實驗材料
        1.1.1 質粒載體與細胞系
        1.1.2 主要試劑
        1.1.3 主要儀器
    1.2 實驗方法
        1.2.1 Lw Cas13a蛋白的誘導表達
        1.2.2 Lw Cas13a蛋白的純化
        1.2.3 Lw Cas13a蛋白的Western Blot鑒定
        1.2.4 Lw Cas13a蛋白的活性檢測
        1.2.5 基于PCR和 CRISPR的HBV DNA檢測方法的建立
        1.2.6 數(shù)據(jù)分析
    1.3 結果
        1.3.1 Lw Cas13a蛋白電泳鑒定
        1.3.2 Lw Cas13a蛋白的Western Blot檢測
        1.3.3 Lw Cas13a蛋白活性檢測
        1.3.4 CRSPR-LwCas13a結合PCR的PCR-CRISPR檢測方法的建立
    1.4 討論
    1.5 本章小結
第二章 基于PCR-CRISPR方法的血清樣本HBV DNA的高靈敏檢測
    2.1 實驗材料
        2.1.1 血清樣本
        2.1.2 質粒及引物
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 血清樣本核酸提取
        2.2.2 血清樣本HBV DNA的PCR-CRISPR檢測
        2.2.3 血清樣本HBV DNA的qPCR檢測
        2.2.4 血清樣本HBV DNA的ddPCR檢測
        2.2.5 數(shù)據(jù)分析
    2.3 結果
        2.3.1 臨床信息已知的血清樣本HBV DNA的檢測
        2.3.2 臨床信息未知的血清樣本HBV DNA的檢測及與qPCR的比較
        2.3.3 血清樣本HBV DNA的ddPCR驗證
        2.3.4 PCR-CRISPR與ddPCR檢測HBV DNA的結果比較
    2.4 討論
    2.5 本章小結
第三章 基于CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的乙肝病毒YMDD耐藥突變檢測方法的建立
    3.1 實驗材料
        3.1.1 質粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 乙肝病毒YMDD耐藥突變檢測方法的設計
        3.2.2 YMDD區(qū)基因序列分析及耐藥突變質粒的構建
        3.2.3 YVDD和YIDD耐藥突變crRNA的設計
        3.2.4 YVDD和YIDD耐藥突變crRNA的特異性檢測
        3.2.5 YMDD耐藥突變的靈敏度檢測
    3.3 結果
        3.3.1 .YMDD突變區(qū)序列的保守性分析
        3.3.2 YVDD和YIDD耐藥突變crRNA的設計效果
        3.3.3 YMDD突變檢測的靈敏度
    3.4 討論
    3.5 本章小結
第四章 基于PCR-CRISPR方法的血清樣本乙肝病毒YMDD耐藥突變的檢測
    4.1 實驗材料
        4.1.1 血清樣本
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 血清樣本核酸提取
        4.2.2 直接測序法檢測血清樣本中的YMDD突變
        4.2.3 qPCR法檢測血清樣本中的YMDD突變
        4.2.4 PCR-CRISPR檢測血清樣本中的YMDD突變
        4.2.5 PCR-CRISPR檢測血清樣本YMDD突變的效果評價
    4.3 結果
        4.3.1 血清樣本YVDD突變檢測
        4.3.2 血清樣本YIDD突變檢測
        4.3.4 血清樣本YMDD突變的測序驗證
        4.3.5 PCR-CRISPR檢測血清樣本YMDD突變的效果評價
    4.4 討論
    4.5 本章小結
第五章 結論與展望
參考文獻
附錄A HBV DNA靶點序列保守性分析結果
附錄B 280份血清樣本基本信息
附錄C 用于突變檢測的144份血清樣本基本信息
作者在學期間取得的學術成果
主要簡歷
致謝



本文編號：3864458