目的:收集、分離和純化江西地區(qū)白念珠菌臨床菌株,監(jiān)測白念珠菌對臨床常用的氟康唑（Fluconazole,FLU）、伊曲康唑（Itraconazole,ITR）、酮康唑（Ketoconazole,KETO）、5-氟胞嘧啶（5-Flucytosine,5-FC）和兩性霉素B（Amphotericin B,Am B）等5種抗真菌藥物的敏感性,獲得主要流行型別中的耐藥菌株,也為臨床白念珠菌感染診治提供一定的依據(jù)。通過RNA-seq技術(shù)獲得耐藥菌株5508（對FLU、ITR、KETO和5-FC耐藥）在5-FC、ITR和5-FC聯(lián)用ITR藥物處理下分別對比無藥處理的差異表達(dá)基因,進一步采用融合PCR介導(dǎo)的LEU-HIS-ARG基因敲除策略、Spot assay和生長曲線實驗等探討差異表達(dá)基因（QDR1基因）與白念珠菌耐藥性的關(guān)系,為下一步探索白念珠菌耐藥機制奠定基礎(chǔ)。方法:1.收集、分離和純化臨床菌株,利用CHROMagar顯色培養(yǎng)基和多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction,M-PCR）鑒定法對念珠菌臨床標(biāo)本進行鑒定,獲得白念珠菌臨床菌株;2.依照美國臨... 

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
中英文縮略詞表
第1章 引言
    1.1 白念珠菌
    1.2 白念珠菌轉(zhuǎn)錄組測序
    1.3 白念珠菌基因敲除
    1.4 本論文的主要內(nèi)容
    1.5 本論文的研究意義
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器和設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液的配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株的培養(yǎng)及保存
        2.2.2 臨床念珠菌標(biāo)本的鑒定
            2.2.2.1 多重PCR鑒定
            2.2.2.2 科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定
        2.2.3 體外抗真菌藥物敏感性實驗
            2.2.3.1 藥敏板的配制
            2.2.3.2 菌懸液的制備與接種
            2.2.3.3 孵育及結(jié)果判讀
        2.2.4 白念珠菌RAPD基因分型實驗
        2.2.5 白念珠菌總RNA的提取
        2.2.6 高通量測序及轉(zhuǎn)錄組分析
            2.2.6.1 菌株處理和總RNA的提取
            2.2.6.2 cDNA文庫構(gòu)建和測序
            2.2.6.3 測序數(shù)據(jù)處理與分析
        2.2.7 熒光定量PCR
        2.2.8 酸化玻璃微珠法提取白念珠菌基因組DNA
        2.2.9 PCR介導(dǎo)的同源重組基因敲除組件構(gòu)建
            2.2.9.1 PCR同源臂和篩選標(biāo)記
            2.2.9.2 PCR片段切膠回收
            2.2.9.3 融合PCR擴增同源重組基因敲除組件
            2.2.9.4 乙醇沉淀純化DNA片段
        2.2.10 乙酸鋰法轉(zhuǎn)化白念珠菌
        2.2.11 同源重組基因敲除突變株陽性克隆的驗證
            2.2.11.1 營養(yǎng)型鑒定陽性克隆
            2.2.11.2 PCR鑒定陽性克隆
        2.2.12 白念珠菌細(xì)胞計數(shù)
        2.2.13 質(zhì)粒小量抽提
        2.2.14 白念珠菌生長曲線測定
        2.2.15 SpotAssay
        2.2.16 生物信息學(xué)方法
第3章 結(jié)果
    3.1 白念珠菌耐藥菌株的獲得
        3.1.1 臨床念珠菌的分離、純化和鑒定
        3.1.2 臨床白念珠菌抗真菌藥物敏感性
        3.1.3 臨床白念珠菌RAPD基因分型
    3.2 白念珠菌轉(zhuǎn)錄組測序
        3.2.1 白念珠菌總RNA的提取與文庫構(gòu)建
        3.2.2 測序數(shù)據(jù)整理及質(zhì)量評估
        3.2.3 參考基因組注釋與基因組定位分析
        3.2.4 比對分析
        3.2.5 基因表達(dá)差異分析
        3.2.6 差異表達(dá)基因的GO分析
        3.2.7 差異表達(dá)基因的KEGG分析
        3.2.8 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的熒光定量PCR驗證
    3.3 QDR1基因與白念珠菌耐藥性關(guān)系初探
        3.3.1 QDR1基因缺失突變株的構(gòu)建
            3.3.1.1 敲除組件的PCR擴增
            3.3.1.2 對QDR1基因缺失突變株的鑒定
        3.3.3 QDR1基因?qū)Π啄钪榫拐婢幬锩舾行缘挠绊?br>        3.3.4 QDR1基因?qū)晟L的影響
第4章 討論
    4.1 白念珠菌耐藥菌株的獲得
    4.2 白念珠菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)
    4.3 QDR1基因與白念珠菌耐藥性的關(guān)系
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀碩士期間研究成果
綜述


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]深部真菌感染治療的現(xiàn)狀與對策[J]. 廖萬清,顧菊林.  中國感染與化療雜志. 2007(02)

博士論文
[1]深部念珠菌的基因診斷、分子分型及耐藥機制研究[D]. 李勁松.天津醫(yī)科大學(xué) 2004



本文編號：3693981