甲狀旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）是檢測(cè)腎臟疾病,包括其多種并發(fā)癥（如繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)）過(guò)程的主要指標(biāo)。納米抗體體積小、親和力高、穩(wěn)定性好、易于融合表達(dá),是PTH相關(guān)疾病診斷與治療的重要材料。但前期研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是基于傳統(tǒng)疏水作用或是無(wú)連接臂的羧基端定點(diǎn)包被PTH篩選方法,均很難獲得能夠特異結(jié)合PTH的納米抗體,造成該結(jié)果的原因可能是上述包被方法影響了PTH的天然構(gòu)象或由于空間位阻影響了抗原抗體有效結(jié)合,因此需要建立一種新的抗原包被方法,既能使PTH定點(diǎn)固載又能使其充分伸展、保持天然構(gòu)象。本論文將借助生物素連接酶（biotin ligase,BirA）的定點(diǎn)修飾作用以及生物素與鏈霉親和素間的特異結(jié)合作用,建立以鏈霉親和素為介導(dǎo),將定點(diǎn)生物素修飾的PTH進(jìn)行定向固載,然后篩選納米抗體的方法;為了便于獲得穩(wěn)定足量的定點(diǎn)生物素化目標(biāo)蛋白,本論文還建立了一種簡(jiǎn)單的BirA定向固定化方法。研究結(jié)果如下:（1）Co³⁺介導(dǎo)的BirA固定化:在H₂O₂的作用下,NTA-Co²⁺-... 

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 蛋白質(zhì)的定點(diǎn)修飾
        1.1.1 定點(diǎn)修飾的方法
        1.1.2 蛋白質(zhì)生物素化修飾
        1.1.3 生物素-鏈霉親和素定點(diǎn)技術(shù)的應(yīng)用
    1.2 固定化酶
        1.2.1 蛋白酶的固定化方式
        1.2.2 固定化酶的應(yīng)用
    1.3 甲狀旁腺激素
        1.3.1 甲狀旁腺激素概述
        1.3.2 甲狀旁腺激素代謝與慢性腎衰竭
        1.3.3 甲狀旁腺激素的檢測(cè)
    1.4 納米抗體技術(shù)
        1.4.1 納米抗體概述
        1.4.2 納米抗體的應(yīng)用
        1.4.3 噬菌體展示庫(kù)技術(shù)
        1.4.4 抗PTH納米抗體的篩選
    1.5 本論文的研究目的、內(nèi)容及意義
2 生物素連接酶的定點(diǎn)固載
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 材料與試劑
    2.3 主要儀器和耗材
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 BirA的表達(dá)和純化
        2.4.2 Avi tag底物的表達(dá)和純化
        2.4.3 BirA的定點(diǎn)固載
        2.4.4 BirA酶催化活性檢測(cè)
        2.4.5 His標(biāo)簽位置對(duì)BirA固載的影響
        2.4.6 EDTA對(duì)固定化BirA穩(wěn)定性及活性的影響
        2.4.7 咪唑濃度對(duì)固定化BirA催化過(guò)程的影響
    2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
        2.5.1 BirA酶和VAD-Avi-His的表達(dá)純化與活性分析
        2.5.2 H2O2對(duì)BirA固載效率和酶活性的影響
        2.5.3 His標(biāo)簽位置對(duì)BirA固載的影響
        2.5.4 EDTA和咪唑?qū)梯dBirA穩(wěn)定性及活性的影響
    2.6 小結(jié)
3 固定化生物素連接酶的評(píng)價(jià)及應(yīng)用
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 材料與試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 HABA檢測(cè)法
        3.3.2 不同pH對(duì)固載酶穩(wěn)定性的影響
        3.3.3 不同溫度對(duì)固載酶穩(wěn)定性的影響
        3.3.4 固載酶的重復(fù)使用及貯存時(shí)間
        3.3.5 攜帶Avi標(biāo)簽PTH序列的設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.6 PTH-Avi-His的表達(dá)與純化
        3.3.7 PTH-Avi-His生物素化
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        3.4.1 不同pH和溫度處理對(duì)固載酶活性的影響
        3.4.2 固定化酶的重復(fù)使用及貯存時(shí)間對(duì)酶活性影響
        3.4.3 PTH-Avi-His的可溶表達(dá)及純化
        3.4.4 利用固定化BirA生物素化PTH-Avi-His
    3.5 小結(jié)
4 生物素-鏈霉親和素體系篩選納米抗體
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 材料與試劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 PTH的表達(dá)純化
        4.3.2 測(cè)定噬菌體庫(kù)的滴度
        4.3.3 納米抗體篩選步驟
        4.3.4 噬菌體ELISA定性檢測(cè)篩選結(jié)果
        4.3.5 納米抗體序列的獲得
        4.3.6 抗PTH納米抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.7 抗PTH納米抗體的表達(dá)及分離純化
        4.3.8 利用Biacore測(cè)定納米抗體親和常數(shù)
        4.3.9 抗PTH納米抗體的ELISA活性檢測(cè)
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        4.4.1 PTH的表達(dá)與純化
        4.4.2 噬菌體庫(kù)的滴度測(cè)定結(jié)果
        4.4.3 噬菌體庫(kù)篩選抗PTH納米抗體
        4.4.4 PCR獲取納米抗體序列
        4.4.5 序列分析結(jié)果
        4.4.6 納米抗體表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果
        4.4.7 目的蛋白的表達(dá)與純化
        4.4.8 納米抗體親和常數(shù)檢測(cè)
        4.4.9 ELISA檢測(cè)納米抗體的活性
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A His-BirA酶的序列設(shè)計(jì)
附錄B PTH-Avi-His的序列設(shè)計(jì)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Detection of pancreatic cancer with normal carbohydrate antigen 19-9 using protein chip technology[J]. Xiao-Li Jin,Bin Xu,Yu-Lian Wu.  World Journal of Gastroenterology. 2014(40)

碩士論文
[1]攜帶定點(diǎn)固載標(biāo)簽的人PTH表達(dá)純化及其納米抗體的淘選[D]. 王玉鳳.大連理工大學(xué) 2014



本文編號(hào)：3690359