銅綠假單胞菌芳香硫酸酯酶（PAAS）為專利保護單通道雙酶同測ELLSA新方法的候選配對標記酶及潛在化學發(fā)光新標記酶,對其進行分子工程改造篩選高活性突變體過程中,首次發(fā)現(xiàn)在最適反應pH及溫度下,以對硝基苯酚硫酸鉀（PNS）為底物、不存在任何抑制劑的反應體系中,PAAS/突變體有不同程度的反應失活現(xiàn)象,即自催化反應失活。通過動力學測定、抗PAAS多克隆抗體和特定多肽影響及結(jié)構(gòu)分析等表征,推測可能機制,由此建立并優(yōu)化自催化反應失活動力學模型,且擬合抗PAAS多克隆抗體和多肽影響的動力學過程,從而探討PAAS自催化反應失活機制,并探索與其失活相關(guān)結(jié)構(gòu)因素,以期在分子改造過程中合理阻斷PAAS反應失活。1.PAAS/突變體反應失活1)同一反應條件下,連續(xù)監(jiān)測PAAS/突變體在相同底物濃度及不同底物濃度下反應動力學曲線,PAAS/突變體作用于其合成底物PNS時,動力學曲線出現(xiàn)不同程度的彎曲現(xiàn)象,即自催化反應失活;反應失活程度與底物濃度有關(guān)。突變體M72K反應失活現(xiàn)象最明顯;超高分辨質(zhì)譜檢測催化反應前后酶分子改變,發(fā)現(xiàn)M72K有氨基酸硫酸化共價修飾;2)引入抗PAAS多克隆抗體及合成的多肽（檢測出發(fā)... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

PAAS/定點突變體催化反應動力學曲線

期間穩(wěn)定性反應失活最嚴重的突變體 M72K 反應期穩(wěn)定性對反應失活的影響o analyze thermostability of M72K during catalytic reaction procesType (%) 0min 5min 10min 30minM72K 100.0% 96.2% 104.9% 98.4%的 M72K 純酶樣品置于室溫，在設定的時間點取酶樣并加果顯示 (表 2)，置于室溫持續(xù) 30min 后，M72K 活力下降K 反應期間穩(wěn)定性并非是其失活的主要原因。 M72K 反應失活的影響

制率仍低于 15%；室溫下，30 min 內(nèi) M72K 活性僅下降 5%，反應期間；M72K 的 Km值為 32±1 μmol/L，最適反應 pH 為 9.0，以 3 mM PNS 為濃度，該濃度遠大于 M72K 的 Km值，但 20 min 內(nèi)產(chǎn)物約生成 30 μM，足預設底物濃度的 1% (圖 3)，此為非正常情況的酶失活現(xiàn)象。該現(xiàn)象的物抑制、酶反應期間穩(wěn)定性、底物過度消耗、反應 pH 與溫度皆無關(guān)，濃度依賴性，由此推測，此特殊酶失活現(xiàn)象可能是 M72K 酶蛋白在催化自身發(fā)生某種變化所引起，即自催化反應失活。M72K 反應失活中間體檢測 質(zhì)譜檢測催化反應前后 M72K 酶蛋白


本文編號：3390042