耳聾是一種常見的遺傳病,遺傳異質性高、人群攜帶率高,診斷價值高,普篩需求高。目前已發(fā)現有100多個基因與耳聾發(fā)生相關,中國遺傳性耳聾的發(fā)病率約為1-3/1000,每年大約新增6萬聾兒,包括3.5萬新生聽力障礙兒童和2.5萬遲發(fā)性和藥物性耳聾。耳聾的高發(fā)病率歸結于中國人群約4-5%的突變基因攜帶率,基因突變檢測具有很高的診斷價值。因此,本研究基于微液滴數字PCR（Droplet digital PCR,ddPCR）以口腔拭子為檢測樣本建立了耳聾常見突變位點無創(chuàng)檢測方法,尤其是首次實現了藥物性耳聾基因突變異質率的精準定量檢測。此外,以孕婦血漿游離DNA（Cell-free DNA,cfDNA）為檢材進行了耳聾無創(chuàng)產前檢測的（Noninvasive prenatal testing,NIPT）初步研究。研究結果顯示基于ddPCR的檢測方法簡便快速、靈敏度高、精準可靠是一種有前景的無創(chuàng)耳聾基因突變檢測方法。首先,本研究基于ddPCR以口腔拭子為檢測樣本建立了超高靈敏度的耳聾無創(chuàng)檢測方法,該方法極大降低了檢測模板量且不會對被檢測者造成創(chuàng)傷。目前耳聾突變檢測方法主要有微陣列基因芯片、質譜、測序技術... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２．１實驗流程

為了驗證方法的特異性，對８個位點分別設計了?４組ｄｄＰＣＲ擴增實驗，分別為??野生型組、突變型組、雜合型組和陰性對照組。每組實驗重復３次。實驗結果顯示??８個位點的特異性為１００％。從８個位點的一維液滴檢測圖看（圖２．２），８個位點陰??性對照組均未檢測到陽性信號證明ＰＣＲ擴增體系無污染。野生型組ＦＡＭ通道檢測??至酬性信號，ＶＩＣ通道未檢測到陽性信號。突變型組ＶＩＣ通道檢測到陽性信號，ＦＡＭ??通道未檢測到陽性信號。雜合型組ＦＡＭ和ＶＩＣ通道同時檢測陽性信號。最終檢測??結果與預期結果一致。從液滴擴增圖中可以看到雜合型組有兩條陽性液滴條帶，是??由于在高拷貝模板濃度下野生型和突變型同時進入一個液滴并同時擴增造成的雙??陽性擴增。從定量結果看，野生型組和突變型組定量拷貝數與預期投入拷貝數一致，??雜合型組兩個通道檢測的拷貝數接近１：１且與野生型組和突變型組的定量結果接近，??上述結果證明野生型和突變型在擴增上不存在互相干擾。??５５??

３００ｄｅｌＡＴ純合??突變，分別對切割后的１／２、１／４和１／８大小進行ＤＮＡ提取及Ｑｕｂｉｔ３．０定量檢測，??結果見圖２．４。從定量結果看（表２．１０），不同干血斑樣本提取的ＤＮＡ含量有差異，??所有樣本隨著千血斑面積減少，提取的ＤＮＡ含量逐漸降低。當千血斑減少至１／８??時與１／２大小干血斑提取的ＤＮＡ總含量之間有顯著差異（Ｐ＜０．０５）。雖然１／８干血??斑提取的ＤＮＡ含量顯著降低，但仍然可以穩(wěn)定提取出滿足本研究需求的ＤＮＡ含量。??進一步通過ｄｄＰＣＲ對２３例干血斑樣本進行特異性檢測，樣本包含野生型樣本??３例，８個檢測位點的雜合型樣本１１例，純合突變型樣本９例。將２３例直徑６?ｍｍ??的千血斑等比切割成１／８大小后，進行Ｑｕｂｉｔ３．０和ｄｄＰＣＲ定量檢測，結果見表２．１０。??從檢測結果看，２３例１／８大小干血斑提取的ＤＮＡ總量為５．５８－５１．９０?ｎｇ。本方法對??２３例１／８大小干血斑樣本的檢出率為１００％，與己知芯片檢測結果及Ｓａｎｇｅｒ測序結??果比對一致率為１００％。ｄｄＰＣＲ定量的拷貝數與Ｑｕｂｉｔ３．０定量后估算拷貝數比較一??致

【參考文獻】：
期刊論文
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