目的:為更好的評(píng)價(jià)早期腎損傷,選取臨床上常用的靈敏度好的胱抑素C作為檢測指標(biāo)。通過基因重組技術(shù)構(gòu)建、表達(dá)人胱抑素C蛋白,利用雜交瘤技術(shù)制備胱抑素C單克隆抗體,建立胱抑素C熒光免疫層析檢測方法,為臨床早期腎損傷快速檢測提供一種新方法。方法:1.重組質(zhì)粒構(gòu)建:根據(jù)Gen Bank人胱抑素C（NM 000099.3）序列合成目的基因并設(shè)計(jì)亞克隆引物,PCR擴(kuò)增后與PET-28a進(jìn)行雙酶切、連接,轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞,制備BL21（DE3）-pET28 a-CysC重組菌,并采用雙酶切及基因測序鑒定。2.蛋白表達(dá)、純化:誘導(dǎo)重組菌表達(dá)胱抑素C蛋白,優(yōu)化誘導(dǎo)劑IPTG作用濃度及誘導(dǎo)時(shí)間,采用Ni⁺親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物,并將純化獲取的胱抑素C重組蛋白透析復(fù)性,ELISA鑒定重組蛋白的抗原活性。3.單抗制備:用上述胱抑素C蛋白免疫小鼠,選用免疫效果最佳的小鼠脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株,注入小鼠腹腔,制備單克隆抗體,用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水,并對(duì)純化后的單克隆抗體進(jìn)行效價(jià)、純度、亞型鑒定。4.檢測方法建立:... 

【文章來源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

熒光免疫層析試紙條組成結(jié)構(gòu)

熒光層析試紙條結(jié)果判定

基因測序圖譜

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]胱抑素C評(píng)估社區(qū)獲得性肺炎患者嚴(yán)重程度及預(yù)測住院期間死亡概率的臨床研究[J]. 楊婷,曾子鑒,申永春,王浩,萬春,文富強(qiáng).  華西醫(yī)學(xué). 2018(01)
[2]同型半胱氨酸（Hcy）與血清胱抑素C（CysC）及尿微量清蛋白（U-mALB）聯(lián)合檢測對(duì)高血壓早期腎損傷的診斷價(jià)值[J]. 遲新棟,馬麗,何佳,甘慶雷,李鵬.  中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2017(06)
[3]血清胱抑素C與其它腎功能指標(biāo)對(duì)早期腎功能損害的臨床診斷價(jià)值[J]. 付玉華,張惠.  包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2017(05)
[4]胱抑素C在腎臟疾病的研究進(jìn)展[J]. 王雪,崔燕,趙永利,崔明姬.  中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志. 2017(01)
[5]血清胱抑素C濃度與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系[J]. 梁登攀,周鵬,王秋林,蔡國才,李璐,蔣利成,李文章,楊震,蒲靜.  嶺南心血管病雜志. 2016(05)
[6]胱抑素C在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的變化及意義[J]. 韓智杰.  臨床合理用藥雜志. 2016(07)
[7]人胰島素定量測定試劑盒化學(xué)發(fā)光免疫分析法的建立及方法學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 陳超,彭波,李基.  分子診斷與治療雜志. 2015(05)
[8]血清胱抑素C在慢性腎臟疾病患者中的臨床研究[J]. 陳玉米.  轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志. 2015(03)
[9]原發(fā)性肝癌介入治療的圍手術(shù)期護(hù)理[J]. 王秀玲.  大家健康(學(xué)術(shù)版). 2015(06)
[10]血清胱抑素C對(duì)小兒急性腎功能衰竭的診斷價(jià)值[J]. 霍燕微.  中國醫(yī)藥科學(xué). 2015(04)

博士論文
[1]慢性腎炎和腎臟占位性病變的DTI實(shí)驗(yàn)與臨床研究[D]. 馮強(qiáng).天津醫(yī)科大學(xué) 2014
[2]人胱抑素C抗體制備和檢測方法建立及其方法學(xué)評(píng)價(jià)[D]. 陳婷梅.重慶醫(yī)科大學(xué) 2007
[3]哺乳動(dòng)物朊蛋白與疊朊的原核表達(dá)及牛朊蛋白單抗制備[D]. 張杰.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2006

碩士論文
[1]抗人TK1單克隆抗體的制備及化學(xué)發(fā)光檢測方法的初步建立[D]. 趙二霞.鄭州大學(xué) 2017
[2]NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測方法的建立[D]. 葛新杰.鄭州大學(xué) 2015
[3]丙型肝炎病毒抗體膠體金免疫層析法的初步建立[D]. 齊紅圓.河南師范大學(xué) 2014
[4]胰腺癌等腫瘤標(biāo)志物（CA19-9）單克隆抗體制備及檢測方法的初步建立[D]. 翟晉豫.河南師范大學(xué) 2014
[5]重組人轉(zhuǎn)氨酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及人巨細(xì)胞病毒IgG抗體國家參考品的研制[D]. 徐超.中國食品藥品檢定研究院 2013
[6]人胱抑素C可溶性表達(dá)、多克隆抗體制備及檢測方法的建立[D]. 陳特.重慶醫(yī)科大學(xué) 2012
[7]胱抑素C結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及其與β-淀粉樣蛋白相互作用的研究[D]. 于元.遼寧大學(xué) 2011
[8]一種基于量子點(diǎn)熒光微球的高靈敏度免疫層析技術(shù)初步研究[D]. 白亞龍.上海師范大學(xué) 2010
[9]熒光相關(guān)光譜均相免疫新方法研究[D]. 湯理川.上海交通大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3362135