近年來(lái),人畜共患疾病數(shù)量持續(xù)增加,食物中毒事件頻發(fā),病原菌快速檢測(cè)技術(shù)成為人們生命安全與疫病防治的重要保障�，F(xiàn)有的病原菌檢測(cè)方法,如分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)分析和分子微生物檢測(cè)等方法在食品衛(wèi)生以及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。但這些方法均存在著一些不足,如檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作繁瑣以及成本高等。本論文以沙門氏菌為研究對(duì)象,提出一種基于焦磷酸分析的病原菌快速檢測(cè)策略,針對(duì)病原菌特定基因片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,將提取樣本中的核酸分子進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增（PCR）反應(yīng),通過(guò)直接分析PCR產(chǎn)物中焦磷酸,或者獲取單鏈PCR產(chǎn)物延伸的焦磷酸產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)來(lái)檢測(cè)樣本中是否存在特定的病原菌及其含量。在證實(shí)PCR反應(yīng)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸量與初始DNA模板含量具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上,我們提出的基于焦磷酸分析病原菌快速檢測(cè)技術(shù)包括兩個(gè)步驟:首先,提取樣本中的核酸分子,進(jìn)行病原菌特定片段的PCR反應(yīng),運(yùn)用焦磷酸化學(xué)發(fā)光測(cè)序技術(shù)的原理,將PCR擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下轉(zhuǎn)換為可見(jiàn)光,并依據(jù)可見(jiàn)光的信號(hào)強(qiáng)度與焦磷酸量來(lái)推知PCR初始DNA模板含量。即通過(guò)直接分析PCR產(chǎn)物中焦磷酸的光化學(xué)信號(hào),實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌的... 

【文章來(lái)源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

焦測(cè)序原理圖

圖 2-1 基于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)焦磷酸的原理 基于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)焦磷酸的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以看出，一分號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)測(cè)量熒光信號(hào)的強(qiáng)度就可以用來(lái)檢測(cè)焦中，(DNA)n+dNTP→(DNA)(n+1)+PPi，即 PCR 引物鏈產(chǎn)生一分子的焦磷酸（PPi）。結(jié)合以上的焦磷酸檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)焦磷酸的含量，從而確定 PCR 反應(yīng)濃度的 DNA 定量準(zhǔn)值，首先需要用已知含量的 DNA 模板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化ter（Life Technologies, CarLsbad, USA）定量 DNA 模 DNA 拷貝數(shù)。計(jì)算公式如下：

I. 1×TE 的配制100 mM/L Tris-HCl 和 10 mM/L EDTA（pH8.8），稱 12.11g Tris 和 3.72g EDTA，加入 800 mL 蒸餾水，用 HCl 調(diào) pH 至 8.0 定容至 1L 即制備成 10×TE，稀釋 10倍使用。2.3.2.5 測(cè)量 PCR 擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸量的儀器及其使用方法實(shí)驗(yàn)中用于檢測(cè)熒光信號(hào)的儀器為 BPLC 微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x（Ultra WeakChemiluminescence Analyzaer ，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所），其原理是將發(fā)光的生物或化學(xué)樣品置于黑暗的環(huán)境，用靈敏度極高的光探測(cè)器接受來(lái)自樣品的微弱光，將其轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，再用電路放大，用微機(jī)分析處理，從而獲得樣品系統(tǒng)的發(fā)光信息。其原理如圖 2-2 所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]基于生物素—親和素系統(tǒng)引入的蛋白質(zhì)芯片研究[D]. 崔浩巍.華中科技大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3320617