人類免疫缺陷病毒（HIV）可通過破壞感染者的免疫系統(tǒng)而導致獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）。免疫學檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）和蛋白質(zhì)印跡（WB）是用于HIV感染臨床診斷的常用方法。然而,由于HIV感染后機體需要一段時間才能產(chǎn)生相應的抗體,因此HIV感染的免疫學檢測存在“窗口期”,使HIV感染的早期診斷受到了挑戰(zhàn)。核酸檢測方法因其即使在沒有HIV抗體存在的情況下也能提示病毒感染而受到廣泛關(guān)注。因此,靈敏和特異地檢測HIV相關(guān)基因?qū)τ贖IV感染患者的早期準確診斷和治療至關(guān)重要。鏈置換擴增（SDA）是一種高效的等溫核酸擴增策略。此外,DNA酶因其具有循環(huán)剪切特性也可以用作信號放大單元。在本研究中,基于鏈置換擴增和鎂離子依賴的DNA酶,構(gòu)建了一種新型的熒光傳感方法,用于快速檢測HIV相關(guān)基因。當檢測體系中存在靶DNA時,靶DNA可以與模板DNA鏈雜交并激活鏈置換擴增以產(chǎn)生大量DNA酶序列片段。隨著鎂離子的引入,DNA酶被激活從而循環(huán)剪切標有熒光基團和猝滅基團的底物鏈,使熒光基團和猝滅基團分離而熒光得以恢復。在最佳實驗條件下,所構(gòu)建的傳感方法可實現(xiàn)對靶DNA在線性范圍100 fM-... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

基于鏈置換和DNA酶反應的熒光傳感器檢測HIVDNA原理圖

3 實驗參數(shù)的優(yōu)化：（A）Klenow 片段濃度的優(yōu)化（B）Nb.BbvCI 濃度的優(yōu)化（C）底物濃度的優(yōu)化（D）總反應時間的優(yōu)化Fig. 3 Optimizations of experimental parameters: (A) evaluation of the effect of Klenowgment polymerase concentration, (B) evaluation of the effect of concentration of Nb.BbvCI,) evaluation of the effect of substrate concentration, (D) evaluation of the effect of the totalaction time. When one parameter changed, the others were under their optimal conditions.he error bars represented the standard deviations in three different measurements for eachconcentration4 熒光傳感方法的性能分析在最佳的實驗條件下，對所構(gòu)建的熒光方法的線性范圍和靈敏度進行了評估。圖 4A 所示，熒光強度隨著靶 DNA 濃度的增加而逐漸上升。在 100 fM 至 1 nM靶 DNA 濃度范圍內(nèi)，校準曲線顯示熒光強度（F）（518 nm）與靶 DNA 濃度（C）對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖 4B）。得到的線性方程為 F=17.4847 lg C（pM）

圖 4 通過不同濃度的 HIV DNA 檢測進行動態(tài)范圍和靈敏度分析：靶 HIV DNA 濃度分別為（a）1 nM;（b）100 pM;（c）10 pM;（d）1 pM;（e）100 fM;（f）0 pM。（A）500-600nm 區(qū)域的熒光發(fā)射光譜。（B）熒光信號峰（518 nm 處）與靶 DNA 濃度對數(shù)的關(guān)系Fig. 4 Dynamic range and sensitivity investigation by detecting HIV DNA at variousconcentrations: (a) 1 nM; (b) 100 pM; (c) 10 pM; (d) 1 pM; (e) 100 fM; (f) 0 pM. (A)Fluorescence emission spectra in a region of 500-600 nm. (B) Relationship of fluorescencesignal peak (at 518 nm) with logarithm of target DNA表 2 比較不同的 HIV 相關(guān)基因檢測平臺Table 2 Comparison of different platforms for HIV-related DNA detectionPlatform StrategyaLimit Linear range ReferenceFluorescence T7 exonuclease 9.1 pM 50 pM-8 nM [37]Fluorescence MB and Ag NCs 4.4 nM 10 nM-200 nM [38]


本文編號：3284006