本文關(guān)鍵詞：一種基于部分雙鏈線性DNA探針的HCV RNA熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:丙型肝炎病毒(HCV)是全球范圍內(nèi)引起慢性病毒性肝炎的主要病原體之一。據(jù)統(tǒng)計,全球約有1.7億慢性HCV感染者,我國慢性HCV感染者超過1000萬。HCV感染后發(fā)病隱匿,癥狀不典型,如果不能及早診斷,容易錯過治療的最佳時機,長期慢性感染可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝癌等晚期肝病,對人民群眾的健康構(gòu)成嚴重威脅。HCV RNA是早期診斷HCV的可靠指標,可于感染后1-2周檢測到,比抗-HCV抗體出現(xiàn)提前大約1個月。同時,HCV RNA也可作為慢性HCV感染者抗病毒治療療效的評價指標。目前,國內(nèi)外已有多種HCV RNA檢測試劑,檢測性能各有差異。由于受到經(jīng)濟條件的限制,我國臨床實驗室以國產(chǎn)HCV RNA試劑占主導(dǎo),檢測性能較進口試劑有明顯差異,不能滿足臨床診斷、治療的需求。因此,發(fā)展一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、價格合理的HCV RNA檢測試劑是當前我國HCV研究的主要方向之一。目的:建立一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強、能夠檢出所有HCV基因型及亞型的一步法實時熒光定量RT-PCR方法檢測HCV RNA。方法:本研究利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備HCV RNA標準品。在HCV基因組最保守區(qū)設(shè)計引物、探針,同時設(shè)計并優(yōu)化部分雙鏈線性DNA探針,并與普通單鏈探針比較。優(yōu)化HCV RNA檢測體系中各組分濃度及反應(yīng)條件。設(shè)置并優(yōu)化內(nèi)對照系統(tǒng)。為驗證新的實時熒光定量RT-PCR方法的性能,對該方法進行方法學(xué)性能評價,包括靈敏度、線性范圍、特異性、批內(nèi)及批間重復(fù)性以及與商品化試劑盒同時檢測106份血清樣品的結(jié)果的相關(guān)性和一致性。結(jié)果:本研究成功制備了HCV RNA標準品。優(yōu)化了HCV RNA檢測體系中各組分濃度及反應(yīng)條件,比較發(fā)現(xiàn)部分雙鏈線性DNA探針優(yōu)于普通單鏈探針。通過優(yōu)化內(nèi)對照系統(tǒng),確定每個HCV RNA檢測體系中需加入內(nèi)對照RNA100copies。本研究建立的實時定量RT-PCR方法的線性動態(tài)范圍為100-1×107IU/ml,檢測靈敏度為78 IU/ml。該方法能夠檢出各種常見HCV基因型、亞型,且針對HCV陰性樣品檢測結(jié)果為100%陰性。該方法具有較好的批內(nèi)、批間重復(fù)性,最大變異系數(shù)(CV)分別為1.33%和2.52%。使用新建立的方法與商品化HCV RNA定量檢測試劑盒同時檢測106份抗-HCV抗體陽性的血清樣品,兩種方法的檢測結(jié)果具有很好的相關(guān)性(R2=0.940)和一致性,偏差為-0.05log(IU/ml)。結(jié)論:本研究建立了一種基于部分雙鏈線性DNA探針的實時定量RT-PCR方法檢測HCV RNA。該方法具有高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性,能夠檢出各種常見HCV基因型、亞型,能夠?qū)崿F(xiàn)對血清樣本中HCV RNA準確定量檢測。適用于HCV感染的篩查、診斷,以及慢性HCV感染者抗病毒治療的療效監(jiān)測。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 HCV RNA檢測 實時定量RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R440
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-12
• 材料與方法12-24
• 1 實驗材料12-14
• 1.1 主要試劑12
• 1.2 主要儀器及耗材12-13
• 1.3 臨床樣品13
• 1.4 研究相關(guān)材料的制備13-14
• 2 實驗方法14-24
• 2.1 HCV RNA標準品的制備14-19
• 2.2 HCV RNA檢測體系中引物、探針的設(shè)計與合成19-20
• 2.3 HCV RNA 檢測體系中內(nèi)對照系統(tǒng)的建立20
• 2.4 HCV RNA的提取及純化20-21
• 2.5 HCV RNA檢測體系的優(yōu)化21-22
• 2.6 HCV RNA 檢測體系中兩種探針的比較22
• 2.7 HCV RNA檢測體系的方法學(xué)性能評價22-24
• 結(jié)果24-34
• 3.1 HCV RNA標準品的制備24-26
• 3.2 HCV RNA檢測體系中涉及的寡核苷酸鏈序列26
• 3.3 HCV RNA檢測體系的優(yōu)化26-28
• 3.4 HCV RNA檢測體系中兩種探針的比較28
• 3.5 HCV RNA檢測體系中內(nèi)對照RNA濃度的優(yōu)化28-29
• 3.6 HCV RNA檢測體系的方法學(xué)性能評價29-34
• 3.6.1 靈敏度29
• 3.6.2 線性范圍29-30
• 3.6.3 特異性30-31
• 3.6.4 批內(nèi)、批間重復(fù)性31-32
• 3.6.5 一致性32-34
• 討論34-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-41
• 綜述41-52
• 參考文獻49-52
• 縮略詞表52-53
• 在學(xué)期間的研究成果53-54
• 致謝54

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳俊杰,游樂然,王若菡,張秋萍;生物素-鏈霉抗生物素蛋白鹼性磷酸酶體系標記檢測DNA探針[J];華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1988年04期

2 Urdea MS ,廖國祥;通用DNA探針放大分析系統(tǒng)快速檢測靶DNA[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;1991年02期

3 吳仲梁,李曉虹,韓偉,蔣琴娣;利用商品DNA探針對食品中單核細胞增生李斯特菌的快速檢測評估[J];中國人獸共患病雜志;2002年05期

4 吳文川;羅志飛;;小劑量DNA探針在檢測HPV中的應(yīng)用[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2006年01期

5 樊慧珍;于化鵬;黃文杰;鄧火金;;DNA探針在呼吸機相關(guān)性肺炎病原學(xué)檢測中的診斷價值[J];中國醫(yī)師雜志;2006年08期

6 劉國建,王正國;DNA探針的擴增制備技術(shù)[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;1990年03期

7 楊維平;;DNA探針診斷寄生蟲感染[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊);1991年04期

8 俞曉峰;涂瀛;;應(yīng)用DNA探針雜交技術(shù)研究過氧化氫對志賀氏菌DNA的影響[J];中國消毒學(xué)雜志;1991年03期

9 Reid YA ,陸建英;人類細胞系鑒定中高變DNA探針的應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;1992年02期

10 孫國鳳;開發(fā)使用DNA探針結(jié)合粒子的檢體DNA濃縮法[J];生物技術(shù)通報;1995年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 余朝文;宋運淳;;水稻基因組DNA探針對幾種植物的比較基因組熒光原位雜交[A];中國遺傳學(xué)會植物遺傳和基因組學(xué)專業(yè)委員會2007年學(xué)術(shù)研討會摘要集[C];2007年

2 汪永強;李傳達;袁平宗;羅鵬;婁沖;;地高辛標記DNA探針快速篩選腫瘤細胞株基因表達差異[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

3 肖強;丁海新;宋陽;陽如春;肖偉洪;Tom Brown;;作為DNA探針的熒光堿基核苷[A];第五屆全國化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2007年

4 劉兵;馬占芳;;三角形Ag-Ag_2S復(fù)合納米顆粒及其DNA探針的制備[A];中國化學(xué)會第十三屆膠體與界面化學(xué)會議論文摘要集[C];2011年

5 劉志敏;賈新樂;卞平平;馬占芳;;三角形Ag_2S-Ag復(fù)合納米顆粒及其DNA探針的制備[A];中國化學(xué)會第28屆學(xué)術(shù)年會第9分會場摘要集[C];2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 封科軍;基因檢測和點突變識別的DNA探針及適配體生物傳感新方法研究[D];湖南大學(xué);2009年

2 楊華衛(wèi);兩種DNA探針雜交在檢測結(jié)核桿菌中的應(yīng)用研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1999年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉天府;一種基于部分雙鏈線性DNA探針的HCV RNA熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[D];蘭州大學(xué);2016年

2 任勇;DNA探針在固體電極上的固定以及對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測[D];青島科技大學(xué);2006年

3 陳育宏;DNA探針型配體的合成、表征及其理論研究[D];南京理工大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：一種基于部分雙鏈線性DNA探針的HCV RNA熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：322882