本文關鍵詞：一種基于部分雙鏈線性DNA探針的HCV RNA熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:丙型肝炎病毒(HCV)是全球范圍內引起慢性病毒性肝炎的主要病原體之一。據(jù)統(tǒng)計,全球約有1.7億慢性HCV感染者,我國慢性HCV感染者超過1000萬。HCV感染后發(fā)病隱匿,癥狀不典型,如果不能及早診斷,容易錯過治療的最佳時機,長期慢性感染可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝癌等晚期肝病,對人民群眾的健康構成嚴重威脅。HCV RNA是早期診斷HCV的可靠指標,可于感染后1-2周檢測到,比抗-HCV抗體出現(xiàn)提前大約1個月。同時,HCV RNA也可作為慢性HCV感染者抗病毒治療療效的評價指標。目前,國內外已有多種HCV RNA檢測試劑,檢測性能各有差異。由于受到經(jīng)濟條件的限制,我國臨床實驗室以國產(chǎn)HCV RNA試劑占主導,檢測性能較進口試劑有明顯差異,不能滿足臨床診斷、治療的需求。因此,發(fā)展一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、價格合理的HCV RNA檢測試劑是當前我國HCV研究的主要方向之一。目的:建立一種靈敏度高、穩(wěn)定性好、特異性強、能夠檢出所有HCV基因型及亞型的一步法實時熒光定量RT-PCR方法檢測HCV RNA。方法:本研究利用體外轉錄技術制備HCV RNA標準品。在HCV基因組最保守區(qū)設計引物、探針,同時設計并優(yōu)化部分雙鏈線性DNA探針,并與普通單鏈探針比較。優(yōu)化HCV RNA檢測體系中各組分濃度及反應條件。設置并優(yōu)化內對照系統(tǒng)。為驗證新的實時熒光定量RT-PCR方法的性能,對該方法進行方法學性能評價,包括靈敏度、線性范圍、特異性、批內及批間重復性以及與商品化試劑盒同時檢測106份血清樣品的結果的相關性和一致性。結果:本研究成功制備了HCV RNA標準品。優(yōu)化了HCV RNA檢測體系中各組分濃度及反應條件,比較發(fā)現(xiàn)部分雙鏈線性DNA探針優(yōu)于普通單鏈探針。通過優(yōu)化內對照系統(tǒng),確定每個HCV RNA檢測體系中需加入內對照RNA100copies。本研究建立的實時定量RT-PCR方法的線性動態(tài)范圍為100-1×107IU/ml,檢測靈敏度為78 IU/ml。該方法能夠檢出各種常見HCV基因型、亞型,且針對HCV陰性樣品檢測結果為100%陰性。該方法具有較好的批內、批間重復性,最大變異系數(shù)(CV)分別為1.33%和2.52%。使用新建立的方法與商品化HCV RNA定量檢測試劑盒同時檢測106份抗-HCV抗體陽性的血清樣品,兩種方法的檢測結果具有很好的相關性(R2=0.940)和一致性,偏差為-0.05log(IU/ml)。結論:本研究建立了一種基于部分雙鏈線性DNA探針的實時定量RT-PCR方法檢測HCV RNA。該方法具有高靈敏度、特異性、穩(wěn)定性,能夠檢出各種常見HCV基因型、亞型,能夠實現(xiàn)對血清樣本中HCV RNA準確定量檢測。適用于HCV感染的篩查、診斷,以及慢性HCV感染者抗病毒治療的療效監(jiān)測。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒 HCV RNA檢測 實時定量RT-PCR
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R440
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-12
• 材料與方法12-24
• 1 實驗材料12-14
• 1.1 主要試劑12
• 1.2 主要儀器及耗材12-13
• 1.3 臨床樣品13
• 1.4 研究相關材料的制備13-14
• 2 實驗方法14-24
• 2.1 HCV RNA標準品的制備14-19
• 2.2 HCV RNA檢測體系中引物、探針的設計與合成19-20
• 2.3 HCV RNA 檢測體系中內對照系統(tǒng)的建立20
• 2.4 HCV RNA的提取及純化20-21
• 2.5 HCV RNA檢測體系的優(yōu)化21-22
• 2.6 HCV RNA 檢測體系中兩種探針的比較22
• 2.7 HCV RNA檢測體系的方法學性能評價22-24
• 結果24-34
• 3.1 HCV RNA標準品的制備24-26
• 3.2 HCV RNA檢測體系中涉及的寡核苷酸鏈序列26
• 3.3 HCV RNA檢測體系的優(yōu)化26-28
• 3.4 HCV RNA檢測體系中兩種探針的比較28
• 3.5 HCV RNA檢測體系中內對照RNA濃度的優(yōu)化28-29
• 3.6 HCV RNA檢測體系的方法學性能評價29-34
• 3.6.1 靈敏度29
• 3.6.2 線性范圍29-30
• 3.6.3 特異性30-31
• 3.6.4 批內、批間重復性31-32
• 3.6.5 一致性32-34
• 討論34-37
• 結論37-38
• 參考文獻38-41
• 綜述41-52
• 參考文獻49-52
• 縮略詞表52-53
• 在學期間的研究成果53-54
• 致謝54

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  本文關鍵詞：一種基于部分雙鏈線性DNA探針的HCV RNA熒光定量RT-PCR檢測方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：322882