肝素結合血凝素（HBHA）是分枝桿菌分泌的一種黏附素,它是由致病性分枝桿菌產生的一種糖蛋白,肺外播散性結核重要毒力因素之一。HBHA在胞內分枝桿菌免疫診斷、治療和預防方面的應用研究起重要意義。本文將構建好的pET-32a-HBHA質粒轉入到BL21（DE3）中,在誘導劑IPTG作用下表達HBHA蛋白。經組氨酸鎳柱純化濃縮,SDS-PAGE電泳鑒定,獲得約38 kDa大小,濃度為1.6 mg/ml的HBHA蛋白。應用單克隆抗體技術,以純化的胞內分枝桿菌HBHA蛋白為免疫抗原制備抗胞內分枝桿菌HBHA單克隆抗體,得到三株細胞上清效價為1:1600的細胞株,體內擴大培養(yǎng)后,獲得大量效價為2.56×10⁵的抗體。并以HBHA單克隆抗體作為包被抗體建立胞內分枝桿菌ELISA檢測方法。應用棋盤法優(yōu)化檢測條件,同時試驗對封閉液進行了最佳選擇,對檢測樣品的特異性、敏感性和準確度進行評估,評估結果顯示,該法對其他抗原均無交叉反應,有良好的特異性,能檢測菌體濃度為200個/ml,具有良好的敏感性,檢測準確度高達93.3%,并成功組裝試劑盒。該試劑盒對家畜胞內分枝桿菌病的診斷和防治具有... 

【文章來源】：長春理工大學吉林省

【文章頁數】：49 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 前言
    1.2 非結核分枝桿菌實驗室檢測方法
        1.2.1 細菌學鑒定分枝桿菌
        1.2.2 分子生物學鑒定分枝桿菌
    1.3 黏附素
        1.3.1 肝素結合血凝素
        1.3.2 HBHA結構與功能
    1.4 HBHA研究進展
    1.5 酶聯免疫吸附法
    1.6 研究目的及意義
第二章 胞內分枝桿菌HBHA原核表達及蛋白純化
    2.1 試驗材料
        2.1.1 儀器及藥品
        2.1.2 主要試劑配制
    2.2 試驗內容
        2.2.1 菌體的活化
        2.2.2 pET-32a-HBHA質粒轉化
        2.2.3 菌體擴大誘導
        2.2.4 HBHA蛋白純化及濃度測定
    2.3 試驗結果
        2.3.1 胞內分枝桿菌HBHA蛋白純化
        2.3.2 胞內分枝桿菌HBHA蛋白濃度測定
    2.4 小結
第三章 胞內分枝桿菌HBHA單克隆抗體的制備
    3.1 試驗材料
        3.1.1 儀器及藥品
        3.1.2 試劑
    3.2 試驗方法
        3.2.1 BaLB/C鼠免疫
        3.2.2 骨髓瘤細胞的準備
        3.2.3 飼養(yǎng)細胞的準備
        3.2.4 雜交瘤細胞融合
        3.2.5 雜交瘤細胞株篩選
        3.2.6 雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)
        3.2.7 雜交瘤細胞的凍存與復蘇
        3.2.8 單克隆抗體大量制備
        3.2.9 單克隆抗體效價測定
    3.3 試驗結果
        3.3.1 小鼠免疫
        3.3.2 雜交瘤細胞株建立
    3.4 小結
第四章 胞內分枝桿菌抗鼠全血清的制備
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗方法
        4.2.1 胞內分枝桿菌的復蘇
        4.2.2 胞內分枝桿菌抗血清的制備
    4.3 試驗結果
        4.3.1 胞內分枝桿菌抗鼠血清的制備
    4.4 小結
第五章 胞內分枝桿菌ELISA檢測方法的建立及初步應用
    5.1 試驗材料
        5.1.1 儀器及藥品
        5.1.2 試劑
    5.2 試驗方法
        5.2.1 胞內分枝桿菌雙抗夾心ELISA檢測方法的建立
        5.2.2 檢測條件優(yōu)化
        5.2.3 特異性試驗
        5.2.4 敏感性試驗
        5.2.5 準確度試驗
    5.3 試驗結果
        5.3.1 胞內分枝桿菌雙抗夾心ELISA檢測方法的建立
        5.3.2 單克隆抗體包被最佳濃度與抗鼠血清最佳濃度的確定
        5.3.3 最佳封閉液的確定
        5.3.4 特異性試驗
        5.3.5 敏感性試驗
        5.3.6 準確度檢測
        5.3.7 待測樣品檢測
    5.4 小結
第六章 胞內分枝桿菌ELISA檢測試劑盒的組裝
    6.1 試劑盒特點
    6.2 胞內分枝桿菌ELISA檢測試劑盒使用說明書
結論
致謝
參考文獻
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3204181