癌癥和傳染性疾病等仍為人類健康生活的嚴(yán)重威脅,而相關(guān)的生物標(biāo)志物的快速、準(zhǔn)確檢測是有效應(yīng)對的前提。蛋白和核酸標(biāo)志物是當(dāng)前體外診斷的主要目標(biāo)分子,而針對蛋白檢測的免疫技術(shù)一般敏感性較差,故核酸分子靶標(biāo)為對象的檢測技術(shù)成為主流。核酸檢測中成熟的PCR及其衍生技術(shù)因嚴(yán)格的溫控和精密儀器等需求而限制了應(yīng)用場景。而以環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）為代表的新技術(shù)具有簡便、快速、高特異性和高靈敏性的優(yōu)勢。然而,LAMP等恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)引物設(shè)計(jì)復(fù)雜并受到嚴(yán)格專利保護(hù),制約了真正的應(yīng)用。同時(shí),微流控芯片的流體精準(zhǔn)操控及規(guī)模化集成優(yōu)勢可將核酸檢測步驟高度集成,將明顯降低人工操作步驟、縮短檢測時(shí)間,其固有的微型化優(yōu)勢亦使得便攜式現(xiàn)場多靶標(biāo)高通量的核酸分析成為可能。本研究以基于微流控芯片的多重多靶標(biāo)核酸檢測和新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的研發(fā)為核心,結(jié)合快速樣品前處理技術(shù)基本完成了現(xiàn)場核酸檢測關(guān)鍵技術(shù)體系的構(gòu)建。主要內(nèi)容及結(jié)果如下:（1）以微流控芯片為核心,構(gòu)建了基于LAMP技術(shù)的多重多靶可視化及熒光核酸的現(xiàn)場核酸檢測平臺,實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用于瘧疾疫情防控的6指標(biāo)同時(shí)檢測可視化芯片研發(fā)及應(yīng)用于中東呼吸道綜合征病毒（MERS-CoV... 

【文章來源】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院過程工程研究所)北京市

【文章頁數(shù)】：171 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 生物標(biāo)志物檢測概述
    1.2 核酸分析技術(shù)進(jìn)展
        1.2.1 變溫核酸擴(kuò)增技術(shù)
        1.2.2 恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)
    1.3 微型化核酸檢測技術(shù)
        1.3.1 現(xiàn)場檢測技術(shù)概述
        1.3.2 基于微流控芯片的核酸檢測
        1.3.3 紙基核酸檢測技術(shù)
    1.4 本論文的選題依據(jù)及研究內(nèi)容
        1.4.1 選題依據(jù)及意義
        1.4.2 研究內(nèi)容
第2章 多重可視化微流控LAMP的瘧疾傳播檢測應(yīng)用
    2.1 研究背景
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.2.3 六種目標(biāo)的保守靶序列選擇和LAMP引物設(shè)計(jì)篩選
        2.2.4 LAMP反應(yīng)體系
        2.2.5 蚊子及瘧原蟲核酸提取
        2.2.6 可視化mμLAMP陣列檢測
        2.2.7 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 六種目標(biāo)的特異性基因選擇和LAMP引物設(shè)計(jì)篩選
        2.3.2 六種目標(biāo)的檢測敏感性評價(jià)
        2.3.3 可視化LAMP反應(yīng)的體積影響
        2.3.4 基于mμLAMP的六靶標(biāo)同時(shí)檢測驗(yàn)證
        2.3.5 基于mμLAMP的六靶標(biāo)特異性驗(yàn)證
        2.3.6 基于mμLAMP的不同蚊媒檢測評價(jià)
    2.4 本章小結(jié)
第3章 MERS-CoV多重微流控?zé)晒釲AMP檢測系統(tǒng)
    3.1 研究背景
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.3 四段基因人工質(zhì)粒的構(gòu)建及DNA模板的制備
        3.2.4 四段基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA制備
        3.2.5 LAMP及逆轉(zhuǎn)錄LAMP反應(yīng)體系
        3.2.6 四段基因的LAMP引物設(shè)計(jì)篩選
        3.2.7 四組LAMP引物的敏感性分析
        3.2.8 LAMP及逆轉(zhuǎn)錄LAMP常溫儲(chǔ)存試劑制備
        3.2.9 微流控?zé)晒釲AMP檢測
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 四段MERS-CoV序列的LAMP引物設(shè)計(jì)篩選
        3.3.2 四段MERS-CoV的引物對于RNA的敏感性評價(jià)
        3.3.3 基于Orfla區(qū)段引物的常溫檢測試劑效果評價(jià)
        3.3.4 MERS-CoV多重微流控?zé)晒釲AMP檢測系統(tǒng)的初步應(yīng)用
    3.4 本章小結(jié)
第4章 基于競爭性互補(bǔ)配對的核酸恒溫?cái)U(kuò)增(CAMP)新方法
    4.1 研究背景
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.3 MERS-CoV的orf1a基因改造及CAMP引物設(shè)計(jì)
        4.2.4 Mo1a基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA制備
        4.2.5 CAMP及其衍生反應(yīng)體系
        4.2.6 Mo1a基因的CAMP及衍生反應(yīng)產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶分析
        4.2.7 瓊脂糖凝膠電泳
        4.2.8 Mo1a基因的CAMP反應(yīng)靈敏度分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 CAMP反應(yīng)體系與原理
        4.3.2 CAMP引物設(shè)計(jì)推薦規(guī)則
        4.3.3 CAMP對DNA擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證
        4.3.4 逆轉(zhuǎn)錄CAMP對RNA擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證
        4.3.5 CAMP反應(yīng)中外引物及環(huán)引物的作用
        4.3.6 CAMP及其衍生反應(yīng)的產(chǎn)物分析
        4.3.7 CAMP反應(yīng)靈敏度測試
        4.3.8 CAMP反應(yīng)判定
        4.3.9 CAMP與LAMP技術(shù)的比較
    4.4 本章小結(jié)
第5章 CAMP反應(yīng)體系優(yōu)化
    5.1 研究背景
    5.2 實(shí)驗(yàn)部分
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.3 CAMP引物及模板
        5.2.4 CAMP及其衍生反應(yīng)體系
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 甜菜堿濃度優(yōu)化
        5.3.2 鎂離子濃度的優(yōu)化
        5.3.3 甘油濃度的優(yōu)化
        5.3.4 聚乙二醇濃度的優(yōu)化
        5.3.5 二甲亞砜濃度的優(yōu)化
        5.3.6 甲酰胺濃度的優(yōu)化
        5.3.7 引物體系優(yōu)化篩選
        5.3.8 應(yīng)用于CAMP的熒光染料篩選
        5.3.9 Taqman探針應(yīng)用于CAMP反應(yīng)
    5.4 本章小結(jié)
第6章 CAMP在甲型H1N1病毒檢測中的應(yīng)用
    6.1 研究背景
    6.2 實(shí)驗(yàn)部分
        6.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        6.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        6.2.3 H1及N1基因改造及CAMP引物設(shè)計(jì)
        6.2.4 H1和N1基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA制備
        6.2.5 標(biāo)準(zhǔn)CAMP及衍生反應(yīng)
        6.2.6 甲型流感病毒樣本核酸提取及轉(zhuǎn)錄
        6.2.7 H1和N1的CAMP引物敏感性分析
        6.2.8 H1和N1的CAMP引物對于真實(shí)樣本檢測
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 H1及N1基因的CAMP引物篩選
        6.3.2 H1及N1基因的CAMP加速引物篩選
        6.3.3 H1及N1基因的CAMP引物的可視化檢測
        6.3.4 H1及N1基因DNA的CAMP檢測敏感性
        6.3.5 H1及N1基因RNA的CAMP檢測敏感性測試
        6.3.6 H1及N1基因CAMP引物的特異性驗(yàn)證
        6.3.7 H1及N1基因CAMP檢測的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    6.4 本章小結(jié)
第7章 CAMP在犬病毒檢測中的應(yīng)用
    7.1 研究背景
    7.2 實(shí)驗(yàn)部分
        7.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        7.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        7.2.3 八種犬病毒CAMP引物設(shè)計(jì)篩選
        7.2.4 犬病毒基因組提取
    7.3 結(jié)果與討論
        7.3.1 八種犬感染病毒CAMP引物篩選
        7.3.2 八種犬感染病毒基因的CAMP加速引物篩選
        7.3.3 四種犬病毒實(shí)際檢測
    7.4 本章小結(jié)
第8章 針對CAMP技術(shù)的核酸快速提取
    8.1 研究背景
    8.2 實(shí)驗(yàn)部分
        8.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        8.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        8.2.3 標(biāo)準(zhǔn)OL-CAMP反應(yīng)及PCR反應(yīng)
        8.2.4 簡易核酸提取裝置及使用
        8.2.5 瓊脂糖凝膠電泳分析
    8.3 結(jié)果與討論
        8.3.1 堿濃度核酸提取的影響
        8.3.2 細(xì)菌快速提取核酸CAMP反應(yīng)評價(jià)
        8.3.3 金黃色葡萄球菌提取效果評價(jià)
        8.3.4 病毒提取效果評價(jià)
    8.4 本章小結(jié)
第9章 基于微流控CAMP的鯉科魚皰疹病毒現(xiàn)場檢測
    9.1 研究背景
    9.2 實(shí)驗(yàn)部分
        9.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        9.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        9.2.3 病魚樣本核酸提取
        9.2.4 CyHV-2及CyHV-3的CAMP引物篩選及設(shè)計(jì)
        9.2.5 標(biāo)準(zhǔn)CAMP及衍生反應(yīng)
        9.2.6 CyHV-2及CyHV-3的CAMP引物敏感性分析
        9.2.7 CyHV-2及CyHV-3的微流控CAMP檢測
    9.3 結(jié)果與討論
        9.3.1 CyHV-2和CyHV-3的CAMP引物篩選
        9.3.2 CyHV-2和CyHV-3的CAMP加速引物篩選
        9.3.3 CyHV-2和CyHV-3的OL-CAMP引物敏感性
        9.3.4 CyHV-2和CyHV-3的OL-CAMP微流控芯片檢測
    9.4 本章小結(jié)
第10章 基于螺旋環(huán)的核酸恒溫?cái)U(kuò)增(HAMP)新方法
    10.1 研究背景
    10.2 實(shí)驗(yàn)部分
        10.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與藥品
        10.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        10.2.3 MERS-CoV orf1b的HAMP引物設(shè)計(jì)
        10.2.4 Mo1b基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備
        10.2.5 HAMP及其衍生反應(yīng)體系
        10.2.6 Mo1b基因的HAMP及衍生反應(yīng)產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶分析
        10.2.7 瓊脂糖凝膠電泳分析
        10.2.8 Mo1b基因的HAMP反應(yīng)靈敏度分析
    10.3 結(jié)果與討論
        10.3.1 HAMP與PSR反應(yīng)原理及比較
        10.3.2 HAMP引物設(shè)計(jì)推薦規(guī)則
        10.3.3 HAMP對DNA擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證
        10.3.4 HAMP反應(yīng)靈敏度測試
        10.3.5 AHAMP反應(yīng)靈敏度測試
        10.3.6 RT-AHAMP反應(yīng)靈敏度測試
        10.3.7 HAMP及AHAMP的產(chǎn)物分析
        10.3.8 AHAMP及RT-AHAMP的可視化檢測
    10.4 本章小結(jié)
第11章 結(jié)論與展望
    11.1 主要結(jié)論
    11.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    11.3 后期建議
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號：3199136