目的:探討梅毒螺旋體（Treponema pallidum,Tp）膜蛋白Tp0971誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的分子機(jī)制。方法:以Tp Nichols株基因組為模板,PCR擴(kuò)增Tp0971基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET28a（+）/Tp0971,隨后將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E-.coli Rosseta中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白。經(jīng)去除Tp0971重組蛋白中的內(nèi)毒素后,將其刺激巨噬細(xì)胞,ELISA檢測細(xì)胞因子IL-8、IL-1β和IL-6的分泌水平。并采用Toll樣受體2（TLR2）中和抗體或TLR2 siRNA,以及核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）抑制劑PDTC處理細(xì)胞,觀察TLR2和NF-κB在介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌中的作用。結(jié)果:成功構(gòu)建p ET28a（+）/Tp0791原核表達(dá)載體,并表達(dá)出一相對分子量為29 k D的重組蛋白。ELISA結(jié)果顯示,0.5¹0μg/ml Tp0791能以劑量依賴性方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA沉默TLR2表達(dá),或用TLR2中和抗體封閉后,IL-8、IL-1β和IL-6分泌明顯減少... 

【文章來源】：中國免疫學(xué)雜志. 2017,33(05)北大核心CSCD

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Tp0971基因的PCＲ擴(kuò)增與重組載體的酶切鑒定Fig．1PCＲamplificationofTp0971geneandenzyme

圖1B)。2.2Tp0971誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定Tp0971重組表達(dá)圖1Tp0971基因的PCＲ擴(kuò)增與重組載體的酶切鑒定Fig．1PCＲamplificationofTp0971geneandenzymedigestionofrecombinantvectorNote:A.ElectrophoreticanalysisofTp0971PCＲproductin1%agarosegel.1.DNAmarker;2.PCＲproduct;3.Negativecontrol;B.ＲestrictionmappingofrecombinantplasmidpET28a(+)/Tp0971digestedwithBamHⅠandHindⅢ.1，4.DNAmarker;2.PCＲproduct;3.ＲecombinantplasmidpET28a(+)/Tp0971digestedwithBamHⅠandHindⅢ.體分別加入不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，圖2顯示，37℃下蛋白為可溶性表達(dá)，但加入0.2～1.5mmol/LIPTG對Tp0971表達(dá)無明顯影響。2.3重組蛋白的鑒定Tp0971表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，加入TBST稀釋后的6-His-Tag單抗為一抗，采用Westernblot方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示在29kD初可見明顯的條帶，而對照組無相應(yīng)條帶(圖3)。2.4重組蛋白的純化重組菌用B-PEＲ裂解并經(jīng)Ni-NTA過柱后，用Buffer1、Buffer2以及Eluent進(jìn)行洗脫。SDS-PAGE結(jié)果顯示Buffer2能洗脫所有雜蛋白，而最終Eluent洗脫后產(chǎn)物得到了進(jìn)一步純化(圖4)。2.5Tp0971蛋白對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響因CD11b和CD36是巨噬細(xì)胞表面的特征性分子，因此我們在Tp0971蛋白刺激巨噬細(xì)胞之前，采用Westernblot檢測了PMA處理THP-1細(xì)胞前后細(xì)胞膜上CD11b和CD36表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，未經(jīng)PMA處理的THP-1細(xì)胞表面CD11b和CD36表達(dá)水平低下，經(jīng)160nmol/LPMA誘導(dǎo)后，細(xì)胞膜上CD11b和CD36明顯增高，而內(nèi)參Gα蛋白保持恒定(圖5)，表明THP-1成功誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。此外，未經(jīng)蛋白刺激的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平很低。而用不同濃度Tp0971蛋白刺激后24h后，細(xì)胞上清中IL-8、IL-1β和IL-6水平顯著增高(表1)。為排除?

圖3Tp0971重組蛋白的Westernblot鑒定Fig．3WesternblotidentificationofTp0971recombin-antproteinNote:Lane1.pET28a(+)/Tp0971recombinantprotein;Lane2.Purificatedrecombinationprotein;Lane3.ExpressionbacteriawithpET28a(+).圖4Tp0971重組蛋白純化效果Fig．4PurificationeffectofTp0971recombinantproteinNote:Lane1.SupernatantofbrokenTp0971recombinantprotein;Lane2.Celllysateflow-through;Lane3.Buffer1washedprotein;Lane4.Buffer2washedprotein;Lane5.Buffereluatedprotein;Lane6.Proteinmarker.圖5PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)CD11b和CD36Fig．5PMAinducesTHP-1cellsexpressionofCD11bandCD36表1不同濃度Tp0971對細(xì)胞因子分泌的影響Tab.1EffectsofdifferentconcentrationsofTp0971onsecretionofcytokinesGroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971(0.1mmol/kg)30.7±7.31)46.2±7.51)32.5±4.41)Tp0971(1.0mmol/kg)85.1±6.21)147.9±18.61)163.8±14.51)Tp0971(5.0μg/ml)113.5±5.51)251.3±5.01)209.4±5.61)Tp0971(10.0μg/ml)131.6±10.61)272.5±6.71)212.6±10.21)Note:1)P＜0.05，ascomparedwiththecontrolgroup.圖6TLＲ2siＲNA干擾效果Fig．6SilenceofTLＲ2expressionbysiＲNA圖7Tp0971或TLＲ2抗體對細(xì)胞核中p65含量的影響Fig．7EffectofTp0971orTLＲ2antibodyoncontentofp65innucleus表2抑制TLＲ2和NF-κB對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Tab.2InhibitionofTLＲ2andNF-κBonsecretionofcytokinesinmacrophagesGroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971131.6±10.61)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Molecular cloning of virB12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector[J]. Shiva Mirkalantari,Nour Amirmozafari,Bahram Kazemi,Gholamreza Irajian.  Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2012(07)
[2]梅毒螺旋體Tp0971重組蛋白的表達(dá)及其在梅毒血清學(xué)診斷中的初步評價[J]. 曾鐵兵,劉小軍,張躍軍,劉雙全,裴瑞青,趙飛駿,吳移謀.  中國病原生物學(xué)雜志. 2010(06)



本文編號：3133697