Armored RNA技術是近年來發(fā)展起來的一種主要用于制備RNA質控品和標準品的技術。其原理是利用基因工程手段將載有大腸桿菌MS2噬菌體衣殼蛋白的基因序列和外源性基因序列克隆到表達載體中,然后將外源性基因片段轉錄成RNA,并包裹在MS2衣殼蛋白基因表達的衣殼蛋白中,最終裝配成球狀RNA-蛋白質復合體,一般稱為“盔甲RNA”（armored RNA）,或MS2病毒樣顆粒（MS2 virus-like particle,MS2 VLP）。由于有外層衣殼蛋白的保護,內部的RNA片段能抵抗環(huán)境中存在的RNA酶的降解而保持穩(wěn)定;同時,armored RNA整體結構又很好模擬了病毒的天然屬性。所以,armored RNA技術在疾病診斷,尤其是在感染性疾病的診斷中具有很大的臨床應用價值。我們前期的研究已經(jīng)使用armored RNA技術成功制備了流行性感冒、埃博拉以及中東呼吸綜合征等多種相關疾病病毒的armored RNAs,并在國內成功開展了這些項目核酸檢測的室間質量評價（External quality assessment,EQA）。登革熱是由登革熱病毒引起、經(jīng)伊蚊傳播的一種急性傳染病。登革熱... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：332 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－１登革熱病毒基因組結構示意圖??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｄｅｎｇｕｅ?ｖｉｒｕｓ?ｇｅｎｏｍｅ??

（ＤＥＮＶ１？４），其基因組包括５’端非編碼區(qū)、核心蛋白（Ｃ）、前體膜蛋白（Ｍ）、??包膜蛋白（Ｅ）、非結構蛋白（ＮＳ１，?ＮＳ２ａ，?ＮＳ２ｂ，ＮＳ３，?ＮＳ４ａ，?ＮＳ４ｂ?和?ＮＳ５）??［７］，登革熱病毒基因結構見圖１－１。??目前，熒光定量ＰＣＲ技術（ＲＴ－ｑＰＣＲ）廣泛用于登革熱病毒的檢測和基因分??型［１０，?１２－１４］。但是，在登革熱病毒核酸ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測過程中，一些影響因素，??如核酸抽提方法、檢測方法、儀器類型以及操作人員等都可能引起檢測結果的變??異，造成不同實驗室之間檢查結果缺乏可比性。另外，大多數(shù)實驗室使用的??ＲＴ－ｑＰＣＲ方法沒有經(jīng)過準確度驗證。據(jù)調查，僅１０％的實驗室使用的ＲＴ－ｑＰＣＲ??方法性能良好，而超過８０％的實驗室在登革熱病毒ＲＴ－ｑＰＣＲ核酸檢測過程中缺??乏靈敏度和特異性［１５］。值得注意的是，ＲＴ－ｑＰＣＲ技術是一種極為靈敏的檢查技??術，容易受到環(huán)境中交叉污染的影響，而出現(xiàn)假陽性的結果；另外，登革熱病毒??是一種ＲＮＡ病毒

２．１．?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＶ－ｌ￣４?重組質粒的驗證??２．１．１．?ＰＣＲ?驗證??目的片段進行瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上顯示的圖片（圖１－４）表明??ＤＥＮＶ－１？４目的片段均成功插入ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２重組質粒的ＭＣＳ２位點。??（ｂｐ）??２０００??■１０００??７５０??５００??２５０??。??圖１－４?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＹ－ｌ？４目的片段ＰＣＲ驗證示意圖??注：Ｍ：?２，ＯＯＯｂｐＭａｒｋｅｒ；?１：?ＤＥＮＶ－１；?２：?ＤＥＮＶ－２；?３：?ＤＥＮＶ－３；?４：?ＤＥＮＶ－４；??５：?ＧＡＰＤＨ?（４９６ｂｐ）〇??Ｆｉｇ．?１－４?Ｅｔｈｉｄｉｕｍ?ｂｒｏｍｉｄｅ－ｓｔａｉｎｅｄ?１％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ??ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．??Ｎｏｔｅ：?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＶ－ｌ￣４?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；?Ｍ：?２，０００?ｂｐ?Ｍａｒｋｅｒ；??１：?ＤＥＮＹ－１；?２：?ＤＥＮＶ－２；?３：?ＤＥＮＶ－３；?４：?ＤＥＮＶ－４；?５：?ＧＡＰＤＨ?（４９６ｂｐ）??２．１．２．測序驗證??２．１．２．１．?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＶ－ｌ?測序結果??■?上下游引物測序序列拼接結果與ＤＥＮＶ－１目的片段匹配??Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ＩＤ：?Ｑｕｅｒｙ＿１９６２０１Ｌｅｎｇｔｈ：?２８７２?Ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?Ｍａｔｃｈｅｓ：?１??Ｓｃｏｒｅ?Ｅｘｐｅｃｔ?

【參考文獻】：
期刊論文
[1]實時定量RT-PCR技術測定初治白血病患者常見融合基因轉錄子水平及其標準化的探討[J]. 秦亞溱,李金蘭,主鴻鵠,李玲娣,常艷,郝樂,阮國瑞,劉艷榮,黃曉軍,陳珊珊.  中華血液學雜志. 2007(07)



本文編號：3101653