目的構(gòu)建載內(nèi)皮抑素（Es）重組表達質(zhì)粒的殼聚糖納米基因載體并評價其抑制內(nèi)皮細胞增殖的活性。方法選用真核表達質(zhì)粒p VAX1為重組載體,采用PCR及雙酶切法制備能夠表達Tat PTD-Es融合蛋白的真核表達載體p VAX1/Tat PTD-Es;離子交聯(lián)法制備殼聚糖載基因納米粒,瓊脂糖凝膠電泳篩選處方,檢測納米粒的形態(tài)、Zeta電位及粒徑;采用最佳處方比例制備載重組質(zhì)粒納米載體,轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC,采用ELISA法測定分泌型Tat PTD-Es蛋白的表達量,CCK-8法測定對HUVEC的抑制作用,以上兩個實驗均以LipofectaminTM2000為陽性對照。結(jié)果 p VAX1/Tat PTD-Es的真核表達載體構(gòu)建成功,殼聚糖納米粒Zeta電位（14.3±1.6）m V,粒徑（145±12）nm,納米粒轉(zhuǎn)染HUVEC后細胞上清中Tat PTD-Es的濃度為（182.5±16.3）ng/m L,殼聚糖基因載體轉(zhuǎn)染HUVEC后對細胞有明顯的抑制作用,72 h的抑制率達（53.4±5.4）%（Z=-2.611,P=0.008）。結(jié)論構(gòu)建的殼聚糖納米基因載體能夠成功轉(zhuǎn)染HUVEC并... 

【文章來源】：山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2017,55(07)北大核心

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陽性重組質(zhì)粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ驗證M:DNAmarkerI(100～600bp);1:陽性對照;2～4:陽性重組質(zhì)粒;5:陰性對照

ectamineTM2000轉(zhuǎn)染空載體pVAX1的細胞分別作為陰性對照。1．3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS15．0軟件，每組試驗重復(fù)5次，數(shù)據(jù)以x珋±s表示。在1．2．6中，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。在1．2．7中，CS納米粒(20μg/mL)分別與CSNPs陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)陽性對照比較，均采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2．1重組質(zhì)粒的驗證PCＲ反應(yīng)結(jié)果顯示，陽性重組質(zhì)粒擴增出600bp左右條帶，見圖1。抽提重組質(zhì)粒后經(jīng)EcoＲI、KpnI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，顯示3kb和600bp左右兩條帶。DNA測序表明，重組質(zhì)粒中的TatPTD-Es序列正確，無突變，且插入方向正確。2．2處方篩選2．2．1CS與DNA的最佳包合比篩選瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)CS∶DNA大于或等于20∶1時，DNA可完全滯留在加樣孔中，并且隨著CS比例增加，有更多的納米粒滯留在加樣孔中。圖1陽性重組質(zhì)粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ驗證M:DNAmarkerI(100～600bp);1:陽性對照;2～4:陽性重組質(zhì)粒;5:陰性對照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．圖2重組質(zhì)粒pVAX1/TatPTDEs的雙酶切驗證1:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重組質(zhì)粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．圖3瓊脂糖凝膠電泳篩選CS-DNA最佳包合

eyU檢驗。在1．2．7中，CS納米粒(20μg/mL)分別與CSNPs陰性對照組(轉(zhuǎn)染空載體)及LipofectamineTM2000(20μg/mL)陽性對照比較，均采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2．1重組質(zhì)粒的驗證PCＲ反應(yīng)結(jié)果顯示，陽性重組質(zhì)粒擴增出600bp左右條帶，見圖1。抽提重組質(zhì)粒后經(jīng)EcoＲI、KpnI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2，顯示3kb和600bp左右兩條帶。DNA測序表明，重組質(zhì)粒中的TatPTD-Es序列正確，無突變，且插入方向正確。2．2處方篩選2．2．1CS與DNA的最佳包合比篩選瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，當(dāng)CS∶DNA大于或等于20∶1時，DNA可完全滯留在加樣孔中，并且隨著CS比例增加，有更多的納米粒滯留在加樣孔中。圖1陽性重組質(zhì)粒(pVAX1/TatPTD-Es)的PCＲ驗證M:DNAmarkerI(100～600bp);1:陽性對照;2～4:陽性重組質(zhì)粒;5:陰性對照。Fig．1PCＲresultsofpositiverecombinantplasmid(pVAX1/TatPTD-Es)M:DNAmarkerI;1:Positivecontrol;2-4:Positiverecombinantplasmid;5:Negativegroup．圖2重組質(zhì)粒pVAX1/TatPTDEs的雙酶切驗證1:重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;M1:1kbDNAmarker(1～10kb);M2:D2000DNAmarker(100～2000bp);2:重組質(zhì)粒。Fig．2DoubledigestionofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEsbyrestrictedendonuclease1:DigestionproductsofpositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs;M1:1kbDNAmarker(1-10kb);M2:D2000DNAmarker(100-2000bp);2:PositiverecombinantplasmidpVAX1/TatPTDEs．圖3瓊脂糖凝膠電泳篩選CS-DNA最佳包合比Fig．3ScreeningoftheopticalratioofCSandDNAbyagar-osegelelectrophoresis


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