目的:本研究以質(zhì)粒pet41a為載體骨架,通過雙酶切法從質(zhì)粒pwt-Cas9、pgRNA中獲得目的基因片段,構(gòu)建CRISPR-Cas9載體系統(tǒng),建立一種行之有效的基因編輯的載體,為研究細(xì)菌耐藥基因提供方法;使用熱轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化兩種常用分子技術(shù)手段,制備感受態(tài)細(xì)胞并優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件,獲得最大的轉(zhuǎn)化效率。方法:1.收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2016-2017年臨床分離鑒定的鮑曼不動桿菌菌株105株。2.進(jìn)行藥敏及PCR技術(shù)篩選對卡那霉素敏感且含有OXA23基因的菌株。3.選擇質(zhì)粒pet41a、pgRNA和pwt-Cas9,分析質(zhì)粒核酸序列及酶切位點(diǎn)。使用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI和BgiII分別酶切質(zhì)粒pet41a和pwt-Cas9,獲得具有相同粘性末端的線性質(zhì)粒片段,回收并用T4DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化菌涂布含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行陽性單克隆篩選并測序,構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pet41-Cas9。使用BgiII和XbaI兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切pet41-Cas9和pgRNA,經(jīng)回收純化、連接和轉(zhuǎn)化后篩選陽性單克隆菌落并測序,重組質(zhì)粒命名為pet41a-Cas9-s... 

【文章來源】：寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回族自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

OXA23基因PCR篩選鑒定

圖 2 質(zhì)粒 pET41a-Cas9-pgRNA 構(gòu)建流程圖ematic of construct recombinant plasmid: pET4表 3 質(zhì)粒酶切信息Tab 3 Information of enzyme cut內(nèi)切酶 目的片段大�。╔hoI 和 BgiII 4131XhoI 和 BgiII 5805表 4 反應(yīng)體系Tab 4 Reaction system體積（μl）

雙酶切圖 4 重組質(zhì)粒 pet41a-Cas9 酶切驗(yàn)證Fig.4 Recombinant plasmid pet41a-Cas9 digestionM 為 DNA 標(biāo)志物 Cas9 為質(zhì)粒 pwt-Cas9 PCR 產(chǎn)物 1~15 隨機(jī)篩選菌落 16 空白對照圖 5 重組質(zhì)粒 pET41a-Cas9 的 PCR 篩選鑒定Fig.5 PCR identification of recombinant plasmid: pET41a-Cas9

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3055698