發(fā)布時(shí)間：2021-02-17 03:10

　　研究背景高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的以禽類為主的烈性傳染病,它具有暴發(fā)突然、感染性強(qiáng)、病程進(jìn)展迅速和死亡率高的特點(diǎn),一旦大面積暴發(fā)往往會伴隨巨大經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前針對H7N9、H5N1等高致病性禽流感病毒感染檢測與確診的主要手段是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù),此技術(shù)存在高成本、操作復(fù)雜和需要受過專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)人員等要求,樣本需要經(jīng)過采集、集中、提純等處理程序,增加了病毒擴(kuò)散的幾率,延長了獲得檢測結(jié)果的時(shí)間,往往需要一天以上才能得到檢測結(jié)果�，F(xiàn)存檢測方法無論是血清學(xué)檢測技術(shù)還是分子生物學(xué)檢測技術(shù),在應(yīng)對當(dāng)前禽流感集中暴發(fā)與長期散發(fā)交替、大量隱性感染與少數(shù)發(fā)病感染并存、易感人群普通市民和偏遠(yuǎn)鄉(xiāng)村居民并存的疫情現(xiàn)狀時(shí)有些滯后和困難,往往造成疫情拖延和治療延誤,甚至引燃疫情爆發(fā)。因此,研發(fā)一種操作簡便、檢測快速、價(jià)格相對低廉的檢測高致病性禽流感病毒的方法具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究目的本課題組擬研發(fā)一種高致病禽流感病毒快速檢測便攜式診斷試劑盒,涉及高致病性禽流感病毒捕獲、滾環(huán)擴(kuò)增、自生成引物滾環(huán)擴(kuò)增和可視化顯色等關(guān)鍵技術(shù)。本研究以滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ),探索自生成引物滾環(huán)擴(kuò)增的快... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1 禽流感病毒
        1.1.1 禽流感簡介
        1.1.2 禽流感病毒的結(jié)構(gòu)分類及功能
    1.2 流感病毒分子生物學(xué)檢測技術(shù)
        1.2.1 基于PCR的檢測技術(shù)
        1.2.2 基于核酸序列的檢測技術(shù)
        1.2.3 基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的檢測技術(shù)
    1.3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的分類和特性
        1.3.1 線性和指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增
        1.3.2 鎖式探針滾環(huán)擴(kuò)增
        1.3.3 自生成引物滾環(huán)擴(kuò)增
    1.4 適體概述
    1.5 可視化檢測
    1.6 本課題來源、研究思路與內(nèi)容
        1.6.1 本課題的來源與研究意義
        1.6.2 本課題的研究思路
        1.6.3 本課題的主要內(nèi)容
第2章 滾環(huán)擴(kuò)增方法的研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        2.1.2 試劑配制
    2.2 檢測技術(shù)通用步驟
        2.2.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.2.2 瓊脂糖核酸電泳
    2.3 最佳成環(huán)條件探索
    2.4 最佳擴(kuò)增條件探索
        2.4.1 bstDNA聚合酶和phi29DNA聚合酶擴(kuò)增效果比較
        2.4.2 環(huán)用量探索
        2.4.3 檢測時(shí)間和靈敏度優(yōu)化
    2.5 H7N9特征基因檢測
        2.5.1 H7N9特征基因的獲取
        2.5.2 鎖式探針成環(huán)檢測H7N9特征基因
    2.6 結(jié)果與分析
        2.6.1 最佳成環(huán)條件分析
        2.6.2 最佳擴(kuò)增條件分析
        2.6.3 H7N9檢測驗(yàn)證分析
    2.7 小結(jié)和討論
        2.7.1 小結(jié)
        2.7.2 討論
第3章 自生成引物滾環(huán)擴(kuò)增方法的研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        3.1.2 試劑配制
    3.2 引物三通PG-RCA可行性分析
    3.3 引物三通PG-RCA擴(kuò)增條件優(yōu)化
        3.3.1 改變擴(kuò)增體系buffer
        3.3.2 降低dNTP和酶濃度
        3.3.3 稀釋模板濃度、探針濃度和酶濃度
        3.3.4 改變bst和Nb.Bsml的比例和用量
        3.3.5 改變探針序列
    3.4 PG-RCA影響因素探索
        3.4.1 排查PG-RCA影響因素
        3.4.2 換用限制性切口酶
    3.5 結(jié)果與分析
        3.5.1 PG-RCA可行性分析
        3.5.2 PG-RCA擴(kuò)增條件優(yōu)化分析
        3.5.3 PG-RCA影響因素分析
    3.6 小結(jié)和討論
        3.6.1 小結(jié)
        3.6.2 討論
第4章 可視化檢測
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        4.1.2 試劑配制
    4.2 HNB和EBT顯色條件探索
2+濃度和pH對顯色的影響">        4.2.1 Mg²⁺濃度和pH對顯色的影響
        4.2.2 dNTP濃度對顯色的影響
    4.3 擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證最佳顯色條件
2+和dNTP濃度探索">        4.3.1 最佳Mg²⁺和dNTP濃度探索
        4.3.2 驗(yàn)證最佳顯色條件
    4.4 用HNB顯色法檢測RCA擴(kuò)增的特異性和靈敏度
        4.4.1 特異性檢測
        4.4.2 檢測限探索
    4.5 結(jié)果與分析
        4.5.1 顯色條件探索結(jié)果
        4.5.2 擴(kuò)增反應(yīng)探索最佳條件
        4.5.3 RCA擴(kuò)增技術(shù)特異性和檢測限分析
    4.6 小結(jié)和討論
        4.6.1 小結(jié)
        4.6.2 討論
第5章 適體初探
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        5.1.2 試劑配制
    5.2 石英晶體微天平通用步驟
    5.3 方案設(shè)計(jì)
        5.3.1 檢測病毒方案設(shè)計(jì)
        5.3.2 找尋合適適體
        5.3.3 初步鑒定方案的可行性
    5.4 檢測適體和靶標(biāo)結(jié)合力
        5.4.1 凝膠阻滯驗(yàn)證
        5.4.2 石英晶體微天平驗(yàn)證
    5.5 結(jié)果與分析
        5.5.1 初步分析方案的可行性
        5.5.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析
        5.5.3 石英晶體微天平實(shí)驗(yàn)分析
    5.6 小結(jié)和討論
        5.6.1 小結(jié)
        5.6.2 討論
第6章 結(jié)論
    6.1 研究總結(jié)
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 需進(jìn)一步開展的研究
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷及研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A型流感病毒研究進(jìn)展[J]. 鄒積振,程凱慧,陳為京,于志君.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(32)
[2]H7N9禽流感及相關(guān)疫情分析評估[J]. 林丹,謝劍鋒,嚴(yán)延生.  中國人獸共患病學(xué)報(bào). 2017(03)
[3]核酸適體的篩選及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J]. 靳貴曉,李娟,楊黃浩.  福州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2016(06)
[4]甲型流感病毒NS1、NS2和NS3蛋白的研究進(jìn)展[J]. 譚偉,謝芝勛.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(12)
[5]禽流感病毒基因組及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 司振書,王守山,胡冬民.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(01)
[6]核酸適體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 吳崔晨,胡佳,鄒遠(yuǎn),王馳,劉杰,楊朝勇.  化學(xué)進(jìn)展. 2010(08)

博士論文
[1]禽流感疫情沖擊下養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失評價(jià)及補(bǔ)償政策優(yōu)化研究[D]. 劉明月.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017

碩士論文
[1]H7N9疫情對家禽產(chǎn)業(yè)的影響[D]. 夏云.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016



本文編號：3037332