目的:分析各種蟲媒病毒的公共衛(wèi)生學意義及其在貴州的傳播風險,篩選出部分病毒作為監(jiān)測對象,并基于TaqMan RT-PCR技術(shù),建立出適合貴州省的快速、靈敏、特異的蟲媒病毒檢測方法。為貴州省重要病媒生物防控及病原檢測技術(shù)平臺建設(shè)提供技術(shù)支持。方法:1.查閱相關(guān)文獻確定需要監(jiān)測的蟲媒病毒后,通過GenBank數(shù)據(jù)庫獲得各病毒的全基因序列,使用Bioedit軟件對各病毒的全基因序列進行比對分析,找到高度保守區(qū)域,利用NCBI blast及DNAStar中primer select等軟件輔助手動設(shè)計引物及TaqMan探針,并對多重組合中的多對引物探針的相互影響進行評價。2.運用體外轉(zhuǎn)錄方法合成靶基因的RNA模板,并以制備的RNA標準品為模板進行單重熒光定量RT-PCR檢測,建立標準曲線,評價各體系的靈敏度及重復性;將所有病毒的引物-探針對之間做交叉反應試驗,以評價各體系的特異性。3.在單重熒光定量RT-PCR的基礎(chǔ)上,查閱文獻,根據(jù)病毒所致疾病類型與種屬分類情況將10種病毒初步分成三組,根據(jù)組合信息,在同一體系中同時加入多種引物探針,對多重熒光定量RT-PCR反應體系進行摸索,并通過對退火溫度... 

【文章來源】：貴州醫(yī)科大學貴州省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

DENV-1單重熒光RT-PCR擴增曲線及標準曲線

在 87.20%～102.00%之間，說明建立的單重熒光 RT-PCR 反應體系對于 RNA 模板的擴增比較完全，可以反映模板 RNA 的濃度；以 RNA 標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以 Ct 值的平均值為縱坐標，建立標準曲線，相關(guān)系數(shù)均在 0.99 以上，曲線具有良好的線性。擴增曲線結(jié)果及標準曲線見圖 2-1～2-10。根據(jù)各種病毒的單重熒光定量 RT-PCR 檢測體系的標準曲線，以 CT 值≤ 35 作為陽性標準，計算各引物-探針對單重檢測體系的檢出限，為 101～102copies/PCR，擴增片段大小及靈敏度結(jié)果見表 2-3。圖 2-1 DENV-1 單重熒光 RT-PCR 擴增曲線及標準曲線Fig.2-1 Amplification curve and Standard curve for DENV-1 single-plex qRT-PCR assay

圖 2-3 DENV-3 單重熒光 RT-PCR 擴增曲線及標準曲線Fig.2-3Amplification curve and Standard curve for DENV-3 single-plex qRT-PCR assay圖 2-4 DENV-4 單重熒光 RT-PCR 擴增曲線及標準曲線Fig.2-4 Amplification curve and Standard curve for DENV-4 single-plex qRT-PCR assay


本文編號：2900279