目的利用原核系統(tǒng)對人乳頭瘤病毒（HPV）16型L1蛋白優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行重組表達(dá)與純化,并檢測血清學(xué)反應(yīng)。方法對HPV16型L1蛋白優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行全基因合成,將核酸片段克隆至pET-DsbC原核表達(dá)載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta（DE3）,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá),采用親和層析對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,采用免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）驗(yàn)證重組蛋白的免疫學(xué)活性。結(jié)果成功構(gòu)建了pET-DsbC-HPV16 L1表達(dá)載體,并在大腸埃希菌Rosetta（DE3）中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的可溶性表達(dá)。重組DsbC-HPV16 L1蛋白經(jīng)親和層析進(jìn)行純化,相對分子質(zhì)量為45 000,純度為95%,重組蛋白純化得率為22%。免疫印跡法結(jié)果顯示,重組DsbC-HPV16 L1蛋白可與HPV16型陽性血清產(chǎn)生特異的抗原-抗體反應(yīng),與重組DsbC蛋白或健康人血清無交叉反應(yīng),具有良好的特異性。ELISA結(jié)果顯示,重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性,A450 nm均值為0.56,高于健康人血清和磷酸鹽緩沖液（PBS）陰性對照（A450n... 

【文章來源】：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué). 2020年09期 第928-932頁

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

HPV16 L1 C端核酸PCR鑒定凝膠電泳結(jié)果

Dsb C-HPV16 L1融合表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta(DE3）宿主菌后以IPTG誘導(dǎo)，可獲得目的蛋白的原核表達(dá)，冰浴超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，在目的相對分子質(zhì)量46 000處（Dsb C蛋白為28 000）有明顯的蛋白表達(dá)，目的蛋白占菌體蛋白的30%以上。超聲破碎后的上清液中可溶目的蛋白占表達(dá)蛋白的50%以上。見圖2。超聲破碎后的上清液以親和層析純化，150 mmol/L咪唑洗脫獲得的純化融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，純度為95%，見圖3。采用BCA蛋白定量法（重組蛋白純化得率=純化后的目的蛋白/上樣前上清液總蛋白×50%）計(jì)算得重組蛋白純化得率為22%。

超聲破碎后的上清液以親和層析純化，150 mmol/L咪唑洗脫獲得的純化融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，純度為95%，見圖3。采用BCA蛋白定量法（重組蛋白純化得率=純化后的目的蛋白/上樣前上清液總蛋白×50%）計(jì)算得重組蛋白純化得率為22%。2.3 重組融合蛋白抗原性的免疫印跡法結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人乳頭瘤病毒16型L1蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測[J]. 王愛萍,蔣敏,栗寧,張改平,祁艷華,劉燕凱,席宇,周景明.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2016(04)
[2]人巨細(xì)胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表達(dá)與IgM捕獲ELISA方法建立和應(yīng)用[J]. 孫衛(wèi)國,孫雯娜,侯江厚,楊秉芬,張靈霞.  現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2015 (05)
[3]A型肉毒毒素(BoNT/A)表位多肽單克隆抗體的制備及其效價(jià)評定[J]. 韋耀,韓朋,周旋,孫琦,張寶,萬成松.  中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 2013(18)
[4]Construction of Prophylactic Human Papillomavirus Type 16 L1 Capsid Protein Vaccine Delivered by Live Attenuated Shigella flexneri Strain sh42[J]. Xiao-Feng YANG Xin-Zhong QU Kai WANG Jin ZHENG L(?)-Sheng SI Xiao-Ping DONG Yi-Li WANG Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education,Institute for Cancer Research,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061.China;National Institute for Viral Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100052,China;Department of Obstetrics and Gynecology,First Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(11)
[5]宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析[J]. 谷鴻喜,凌虹,張鳳民,鐘照華,王文閣,郭淑元,婁閣,郭彩玲.  中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志. 1999(01)



本文編號：2896272