自中國首次發(fā)現(xiàn)可轉移性粘菌素耐藥基因mcr-1以來,全球范圍內已有40多個國家和地區(qū)檢測到了mcr-1基因。mcr-1基因可通過質�；蜣D座的形式在不同地區(qū)不同菌屬之間擴散,不僅對公共健康造成巨大威脅,也給臨床抗感染治療帶來重大挑戰(zhàn)。目前檢測到攜帶mcr-1基因的樣本種類與分布地區(qū)眾多,但樣本來源主要集中在動物、生肉、環(huán)境與臨床,其中臨床分離得到的mcr-1陽性菌株相對較少。已報道的能夠攜帶mcr-1的菌種主要為環(huán)境或院內感染相關的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌,而對于mcr-1在引起急性腹瀉的腸致瀉性大腸桿菌、沙門氏菌和志賀菌等重要腸道致病菌中的流行分布情況的研究較少。此外,mcr-1在腸道致病菌中的傳播特性及mcr-1陽性菌的親緣進化關系并不清楚,亟需開展研究。研究目的篩查從部分地區(qū)醫(yī)院腹瀉患者樣本中收集的大腸桿菌、沙門氏菌和志賀菌等重要腸道致病菌,揭示mcr-1基因在腸道病原菌中的分布情況及傳播規(guī)律;分析攜帶mcr-1腸道病原菌的耐藥特點,為多粘菌素耐藥菌的科學治療提供依據(jù);分析人源mcr-1陽性的大腸埃希菌、沙門菌和志賀菌的遺傳特征,為有效監(jiān)測和控制粘菌素耐藥基因mcr-1在人群中的傳播以及暴發(fā)流行的預警提供依據(jù)。研究方法采集腹瀉患者臨床樣本及病人基本信息,按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》對收集的腹瀉標本進行菌株的分離培養(yǎng)與鑒定;利用PCR和Sanger測序對mcr-1基因進行篩檢,通過微量肉湯梯度稀釋法對mcr-1陽性菌進行抗生素敏感性分析;應用PFGE技術對攜帶mcr-1腸道病原菌進行分型;通過S1-PFGE技術與Southern-blot技術對攜帶mcr-1的質粒進行分型與定位;通過質粒接合轉移實驗檢查mcr-1陽性質粒的傳播特性;利用PCR、質粒測序和全基因組高通量測序技術對mcr-1陽性菌株的質粒特點、遺傳多態(tài)性等分子特性進行研究。研究結果1.共收集或分離鑒定2003-2015年間的我國部分地區(qū)的腸道致病菌株共計16950株,其中志賀菌3821株、大腸桿菌1024株、沙門氏菌12105株。共檢出76株mcr-1陽性菌株,其中包括志賀菌7株,沙門氏菌28株,大腸桿菌41株。其中非典型致病性大腸桿菌與鼠傷寒沙門菌的檢出量最多。2.通過對就診患者的基本信息進行統(tǒng)計與分析發(fā)現(xiàn),僅12.86%(9/70)的mcr-1陽性菌分離于成年人樣本,在所有人源性mcr-1陽性樣本中有77.41%(54/70)的樣本來源于4歲以下兒童,兒童患者的平均年齡僅為1.4歲。3.通過對mcr-1陽性菌進行抗生素敏感性分析發(fā)現(xiàn),其中耐藥率最高的3種藥物分別為黏菌素100.00%(76/76)、磺胺異噁唑84.21%(64/76)和四環(huán)素78.95%(60/76);其中敏感性最高的三種藥物分別為環(huán)丙沙星90.79%(69/76),頭孢西丁89.47%(68/76)與阿莫西林克拉維酸鉀80.26%(61/76)。4.mcr-1陽性菌株的多重耐藥現(xiàn)象明顯。有12株(15.79%)菌同時對第三代頭孢和喹諾酮類藥物耐藥,69株(90.79%)菌同時對三種或三種以上抗生素耐藥,只有2株菌僅對黏菌素一種藥物耐藥。mcr-1陽性大腸桿菌、沙門氏菌與志賀菌抗生素耐藥譜有差異。5.所有mcr-1陽性腸道病原菌共檢測到4種質粒骨架類型,分別為Inc X4,Inc I2,Inc HI2與Inc F型。6.mcr-1陽性大腸桿菌中Inc X4型質粒檢出率最高(19/41,46.3%),沙門氏菌Inc H型質粒檢出率最高(13/28,46.0%),志賀菌中只檢測到Inc I質粒類型。7.大腸桿菌PFGE分析結果顯示41株mcr-1陽性大腸桿菌基因組具有異質化特性。在28株沙門氏菌中檢測到具有高度同源的優(yōu)勢菌株。8.通過SNPs進化分析樹發(fā)現(xiàn)部分鼠傷寒沙門菌親緣關系密切,可能是同一個流行的克隆群。研究結論1.在國內首次發(fā)現(xiàn)了攜帶mcr-1基因的人源性宋內志賀菌、人源性旺茲沃思和腸炎型沙門菌,在這些分離到的mcr-1基因的大腸桿菌中,非典型腸致病性大腸桿菌(a EPEC)與鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢型別,而這兩種可導致醫(yī)院感染和暴發(fā)性食物中毒,給公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅。2.在我國上海地區(qū)分離的mcr-1陽性腸道致病菌中,大腸桿菌中的陽性率(4.0%)顯著高于沙門氏菌與志賀菌,并且在無癥狀人群中也檢測到了mcr-1陽性菌株,意味著mcr-1陽性菌在部分地區(qū)已出現(xiàn)傳播,引起感染。3.在攜帶mcr-1基因的樣本中,來源于4歲以下兒童的樣本相對較多,應加強對學校及家庭公共衛(wèi)生安全知識的普及,增強個人消毒防護意識,減少食品與水源污染給兒童健康帶來的威脅。4.mcr-1陽性腸道致病菌多重耐藥的現(xiàn)象十分明顯,攜帶mcr-1的多重耐藥與泛耐藥菌成為臨床治療中面臨的更為棘手的問題。5.不同菌屬的mcr-1腸道致病菌對相同藥物的耐藥差異明顯,其中沙門氏菌對頭孢菌素類和β內酰胺類抗生素表現(xiàn)出較高水平耐藥,并且泛耐藥現(xiàn)象顯著;大腸桿菌對四環(huán)素類和磺胺嘧啶類抗生素表現(xiàn)出較高水平耐藥;志賀菌中有4株同時攜帶阿奇霉素與第三代頭孢菌素抗性,表現(xiàn)出多重耐藥的表型特征。6.攜帶mcr-1的a EPEC型大腸桿菌的異質化趨勢明顯;在上海地區(qū)發(fā)現(xiàn)了收集于2012-2015年間的mcr-1陽性沙門氏菌優(yōu)勢克隆群,推測該克隆群在2015年間可能發(fā)生了傳播造成了感染。7.腸道致病菌所攜帶的mcr-1質粒類型復雜多樣,主要為Inc X4、Inc I和Inc H質粒類型,其中Inc I類型質粒廣泛分布于本次檢測的3種腸道致病菌中;其中致瀉性大腸桿菌攜帶mcr-1質粒類型更復雜多樣,以Inc X4和Inc I為主,沙門菌以Inc H類型質粒為主。8.在SNPs進化分析中親緣關系密切的鼠傷寒沙門菌可能是同一個流行的克隆群。意義和創(chuàng)新1.迄今為止,我國還沒有規(guī)模性的對mcr-1基因在人源性腸道病原菌中分布規(guī)律的調查分析,通過對部分地區(qū)醫(yī)院腹瀉患者樣本中的腸道病原菌進行篩查,我們揭示了mcr-1基因在大腸桿菌、沙門氏菌、志賀菌三類腸道病原菌中的分布情況及傳播規(guī)律,為控制黏菌素耐藥性的傳播提供了可靠的理論依據(jù)。2.通過對收集菌株的篩查,我們研究了mcr-1陽性人源性腸道病原菌在部分地區(qū)的分布狀況、傳播關系、耐藥性特點、遺傳多態(tài)性及傳播機制,為mcr-1陽性腸道病原菌的危害評估提供了科學依據(jù)。3.通過基因組測序分析,我們研究了攜帶mcr-1質粒在腸道病原菌中的轉移特性和不同菌屬間攜帶mcr-1質粒的結構特點,為預防控制此類mcr-1基因的傳播提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：軍事科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

介導的能夠水平轉移的多黏菌素抗性基因 mcr-1最初是在2中國收集的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的[1]。MCR-1胺轉移酶家族，其蛋白的活性位點與磷酸甘油胺轉移酶相似加到類脂 A 從而修飾 LPS，增加了 LPS 攜帶的正電荷，降S 結合的可能性，因此對多粘菌素類藥物產(chǎn)生抗性，其作用色體突變導致的抗性[3]，LPS 在肺炎克雷伯菌中的調控機制菌素抗生素的抗性外，MCR-1 蛋白的存在還可以使菌株對溶在大腸桿菌中，MCR-1 蛋白的存在可以將菌株對多粘菌素的nimuminhibitoryconcentration，MIC）提高 4 到 8 倍。在沒有菌素抗性的因素的作用下，僅通過 MCR-1 蛋白的作用便足以克雷伯菌等一些腸桿菌產(chǎn)生對多粘菌素的抗性。

第 41 頁圖 3. 1 Mate-pair 文庫構建流程（1）基因組 DNA 的片段化處理。所需要的基因組 DNA 的質量約為 5μg，使用特定的配對轉座酶，對基因組 DNA 進行片段化處理，對破碎后的片段通過磁珠進行片段大小的篩選，之后連接上生物素配對接頭，再次用磁珠對加接頭后的片段進行純化。（2）鏈置換反應。使用多聚酶補平 DNA 由于片段化處理造成的缺口，在連接生物素連接頭的 DNA 片段上有一條鏈的末端與連接頭之間有一個小的缺口，鏈置換反應就是補平 DNA 為后面環(huán)化做準備，在操作過程中使用磁珠去除了樣品中小于 1500bp 的小片段，僅保留了含有生物素的大片段。

（4）線性 DNA 的消化過程。通過在樣本中加入 DNA 核酸外切酶去除所有以線性狀態(tài)存在的 DNA，盡可能多的保留完整的環(huán)狀 DNA。在滅活核酸外切酶之后需要加入停止環(huán)化反應的試劑滅活連接酶。（5）剪切環(huán)化DNA.使用超聲破碎儀將環(huán)化的DNA用打斷成約300-1000bp帶有粘性末端的小片斷，過程中用磁珠篩選與純化片段（6）鏈霉親和素珠子吸附，使用能夠特異性吸附包含生物素化接頭的磁珠篩選含有生物素接頭的片段，去除其他片段。（7）末端修復補平。配置修復反應的體系 30℃孵育 30min，之后用磁珠純化獲得的片段。（8）片段加 A 尾。所有片段的 3’末端被加入一個 A 堿基，而與之互補配對的接頭的 3’末端含有一個單個的 T 堿基，因此兩條鏈可以配對連接。（9）在片段末端加接頭，片段加上接頭后需要用磁珠純化，接頭的添加過程如下。
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3 楊立軍,張晶,李杰;GENESTAR技術在胃腸道病原菌診斷中的應用[J];陜西醫(yī)學檢驗;1999年03期

4 江智輝,蒲桂珍,王海清,朱學英;蔬菜、水果等食品腸道病原菌的分布調查[J];中國人獸共患病雜志;1990年05期

5 馬志強;;衛(wèi)生從業(yè)人員腸道病原菌攜帶情況調查[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2008年03期

6 徐海濱,郭維植,陳建輝,王伙聰;實驗獼猴腸道病原菌檢測分析[J];中國比較醫(yī)學雜志;2004年02期

7 陳立新;劉秀軍;劉曉峰;王寶蘭;饒丹;;2010年北京市通州區(qū)腸道病原菌監(jiān)測結果分析[J];中華疾病控制雜志;2011年10期

8 張莉;吳潤;劉磊;;22種中草藥對畜禽常見腸道病原菌的體外抑菌作用[J];甘肅農業(yè)大學學報;2012年05期

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10 劉楠楠;劉菲菲;戰(zhàn)海濤;王蘊;徐淑鳳;;強化氣道管理對呼吸機相關性肺炎發(fā)生率影響的研究[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志;2014年01期

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本文編號：2893719