背景膿毒癥是機(jī)體對于感染的失控反應(yīng)所導(dǎo)致的威脅生命的器官功能障礙,全球每年膿毒癥患病人數(shù)超過1900萬,其中有600萬患者死亡,病死率超過1/4,存活的患者中約有300萬人存在認(rèn)知功能障礙。造成如此高的病死率就是由于膿毒癥以誤診、漏診,所以能及時(shí)準(zhǔn)確檢測細(xì)菌感染標(biāo)志物可以輔助診治膿毒癥,降低病死率。其中降鈣素原(procalcitonin,PCT)和白介素6(interleukin 6,IL-6)作為細(xì)菌感染標(biāo)志物已廣為認(rèn)可,它們均與細(xì)菌感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān),PCT在判斷細(xì)菌和非細(xì)菌性感染時(shí)較為特異,IL-6動(dòng)態(tài)監(jiān)測利于判斷診治效果和預(yù)后。健康人群中PCT和IL-6的濃度分別為小于0.05ng/mL和約為6 pg/mL,而在嚴(yán)重細(xì)菌感染發(fā)生時(shí),又可以分別可高達(dá)100 ng/mL和1000pg/mL�，F(xiàn)行的檢測方法以酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescent immunoassay,CLIA)為主,ELISA操作復(fù)雜、耗時(shí)長、步驟多、價(jià)格昂貴、批量操作,中間過程受影響因素較多,CLIA操作均相對復(fù)雜、耗時(shí)較長、需要大型專業(yè)的設(shè)備、價(jià)格稍貴。現(xiàn)在政府和衛(wèi)健委正大力推進(jìn)分級診療和發(fā)展社區(qū)門診等基層醫(yī)療機(jī)構(gòu),而基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)對感染疾病的診治往往依靠經(jīng)驗(yàn),易造成膿毒癥的誤診、漏診和抗生素濫用,所以需要與之相適應(yīng)的PCT和IL-6檢測方法,ELISA和CLIA對于這樣的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)來講適用性不強(qiáng)。所以現(xiàn)在需要一種快速簡便、易操作和利于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣的方法檢測PCT和IL-6,有助于臨床及時(shí)有效地診治膿毒癥。免疫層析技術(shù)(immunochromatography assay,ICA)是也稱作側(cè)向免疫分析法(lateral flow assay,LFIA),是一種結(jié)合薄層色譜技術(shù)和免疫識(shí)別反應(yīng)的固相免疫分析法,為即時(shí)檢測(point of care testing,POCT)提供了一個(gè)很好的平臺(tái),具有快速、簡便、易操作等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于金屬離子、核酸、蛋白質(zhì)和細(xì)菌等物質(zhì)的檢測。免疫層析技術(shù)的核心就是標(biāo)記物,應(yīng)用到免疫層析的標(biāo)記物有膠體金、碳納米材料、上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米微球(up-converting phosphor nanoparticles,UCP)、量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)、銪納米微球(europium nanoparticles,Eu-np)和磁性納米材料等,而其中Eu-np有著獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì):熒光壽命長,良好的光穩(wěn)定性,stokes位移大(超過150nm),激發(fā)光譜和發(fā)射光譜無交叉,特征峰非常尖銳,標(biāo)記物體積小,標(biāo)記物不會(huì)影響被標(biāo)記物(尤其對蛋白質(zhì)的影響小)的空間立體結(jié)構(gòu),保證了被標(biāo)記物物化性質(zhì)的穩(wěn)定性。由于Eu-np獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì),可很大程度降低非特異性熒光信號而獲得高靈敏度。通過檢測/質(zhì)控(T/C)比值可以對PCT和IL-6進(jìn)行定量檢測。目的本研究根據(jù)時(shí)間分辨技術(shù)和免疫層析技術(shù)的原理,以試紙條為載體,運(yùn)用便攜式免疫熒光分析儀為檢測平臺(tái),研制可快速、簡便、定量檢測PCT和IL-6的時(shí)間分辨免疫層析試紙條,為基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)可以快速準(zhǔn)確診斷膿毒癥奠定了基礎(chǔ)。方法1.PCT時(shí)間分辨免疫層析試紙條的研制:Eu-np活化后分別與雞IgY和PCT捕獲抗體MJG03相偶聯(lián)得到Eu-np-雞IgY和Eu-np-MJG03復(fù)合物,復(fù)合物按各自比例稀釋后噴到結(jié)合墊干燥。NC膜用稀釋的PCT檢測抗體MJG05包被兩條T線,用羊抗雞IgY包被一條C線,然后37℃干燥。組裝完成后,血清樣品用樣品稀釋液作等體積稀釋后加到加樣孔,反應(yīng)15min后用便攜式熒光儀檢測,得到(T_1+T_2)/C比值,根據(jù)在熒光儀中設(shè)置好的標(biāo)準(zhǔn)曲線,直接得到PCT濃度。2.PCT時(shí)間分辨免疫層析試紙條的優(yōu)化及初步應(yīng)用:PCT試紙條從T線劃膜濃度、結(jié)合墊噴膜濃度和檢測時(shí)間3個(gè)方面優(yōu)化,從線性、靈敏度、精密度、特異性、回收率、臨床標(biāo)本比對6個(gè)方面進(jìn)行性能評估。3.IL-6時(shí)間分辨免疫層析試紙條的研制:Eu-np活化后分別與雞IgY和IL-6捕獲抗體MIS02相偶聯(lián)得到Eu-np-雞IgY和Eu-np-MIS02復(fù)合物,復(fù)合物按各自比例稀釋后噴到結(jié)合墊干燥。NC膜用稀釋的IL-6檢測抗體MIS01包被作為T線,用羊抗雞IgY包被一條C線,然后37℃干燥。組裝完成后,血清樣品直接加到加樣孔,反應(yīng)15min后用便攜式熒光儀檢測,得到T/C比值,根據(jù)在熒光儀中設(shè)置好的標(biāo)準(zhǔn)曲線,直接得到IL-6濃度。4.IL-6時(shí)間分辨免疫層析試紙條的優(yōu)化及初步應(yīng)用:IL-6試紙條從檢測時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,從平行測試、線性、靈敏度、回收率、精密度、特異性、臨床標(biāo)本比對7個(gè)方面進(jìn)行性能評估。結(jié)果1.本PCT檢測方法線性良好,線性范圍為0.05~100ng/mL,靈敏度為0.03ng/mL,與CRP、IL-6、IL-8、TNF-ɑ和RA無交叉反應(yīng),批內(nèi)精密度變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)和批間精密度CV分別為1.39%~5.42%和2.00%~6.86,回收率介于95%至101%之間,與AE-180全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀作回歸分析,結(jié)果一致性較好:y=0.9011x+0.4137(n=95,r=0.9936,p0.01),陽性符合率96.61%,陰性符合率94.44%,假陽性率5.56%,假陰性率3.39%和診斷符合率95.53%。2.本IL-6檢測方法線性良好,線性范圍為2~500 pg/mL,靈敏度為0.37 pg/mL,與PCT、IL-8和CRP無交叉反應(yīng),批內(nèi)精密度CV和批間精密度CV分別為5.92%~8.87%和7.59%~9.04%,回收率介于102%至106%之間,與SEIMENS全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀作回歸分析,結(jié)果一致性較好:y=0.9502 x+6.1397(n=214,r=0.9757,p0.01)。結(jié)論1.在不用NHS而單用EDC時(shí)成功活化銪納米微球,可減少操作步驟和節(jié)約試劑。2.PCT檢測和IL-6檢測快速,僅加樣15 min后便可得到檢測結(jié)果,優(yōu)于1 h左右出結(jié)果的CLIA和5 h左右出結(jié)果的ELISA。3.PCT檢測是僅需要50μL血清和50μL樣品稀釋液混勻后加樣,待反應(yīng)完成便可檢測;IL-6檢測僅需血清70μL,待反應(yīng)完成便可檢測。兩種檢測方法均為兩步法,操作簡便,標(biāo)本用量少。4.檢測儀器便宜小型、占地面積小,非專業(yè)人員也可操作,節(jié)約試劑,適于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。5.PCT免疫層析試紙條雙T線捕獲PCT抗原的能力更強(qiáng),有助于提高了靈敏度和線性;在0.05~100 ng/mL范圍內(nèi)線性范圍良好(Y=0.0747X+0.5246,R~2=0.9904),靈敏度為0.03 ng/ml,批內(nèi)精密度CV≤8.76%,批間精密度CV≤6.86%,特異性良好,與AE-180全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀相關(guān)性良好(Y=0.9011X+0.4137,R2=0.9873,p0.01),符合臨床檢測要求。6.IL-6免疫層析試紙條在2~500 pg/mL范圍內(nèi)線性良好(Y=0.0020 X+0.0051,R2=0.9988),靈敏度為0.37 pg/mL,批內(nèi)精密度CV≤8.87%,批間精密度CV≤9.04%,特異性良好,與SIEMENS IMMULITE 1000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀相關(guān)性良好(Y=0.9502X+6.1397,R2=0.9517,p0.01),符合臨床檢測要求。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R446.5;R459.7
【部分圖文】：

圖 2.1 抗體標(biāo)記示意圖組裝品墊(玻璃纖維膜 SB08)切成 21 mm*30 cm 的條帶，把結(jié)合墊（聚 9 mm*30 cm 的條帶，然后分別在樣品墊預(yù)處理液和結(jié)合墊預(yù)處理干燥箱中干燥 4 h 備用。膜貼在 PVC 板上，在 NC 膜上分別包被用包被稀釋液稀釋好的羊和 PCT-MJG05 作為 C 線和 T1、T2線，劃膜量均為 1 μL/cm，37 處理過的結(jié)合墊上噴上被噴膜稀釋液稀釋的 Eu-np-MJG03 和 Eu-n 為 150 倍稀釋，噴膜量為 5 μL/cm，37 ℃干燥箱中干燥 6 h。0 %濕度環(huán)境下依次把干燥好的結(jié)合墊、預(yù)處理過的樣品墊和吸水貼上 PVC 板，切成 4 mm 寬的試紙條（圖 2.2），裝入塑料卡盒中存?zhèn)溆谩?

圖 2.2 PCT 試紙條示意圖2.2.3 試紙條檢測把試紙條從鋁箔袋中取出，加入 100 μL 樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)一段時(shí)間后，把板條插入便攜式熒光檢測儀中檢測，得到（T1+T2）/C(簡化為 T/C)的比值，再根據(jù)儀器內(nèi)置的 PCT 標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此計(jì)算得到 PCT 的濃度。2.2.4 試紙條優(yōu)化2.2.4.1 T 線劃膜濃度優(yōu)化方案 A：單 T 線濃度為 1 mg/mL；方案 B：T1和 T2線濃度分別為 1 mg/mL 和 0.5mg/mL；方案 C：T1和 T2線濃度均為 1 mg/mL 和 1 mg/mL；方案 D：T1和 T2線濃度分別為 1 mg/mL 和 1.5 mg/mL；方案 E：單 T 線濃度為 2 mg/mL。以此確定合適的包被濃度。2.2.2.2 結(jié)合墊噴膜濃度優(yōu)化對 Eu-np-MJG03 分別進(jìn)行 3、4 和 5 倍稀釋，以此確定合適的噴膜濃度。

PCT陽性試紙條檢測
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2890867