第一部分 載IR780靶向多功能納米粒的制備和表征目的 制備載IR780靶向多功能納米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP),對其一般性質(zhì)包括大小、電位、體外靶向性及生物安全性等進(jìn)行檢測。方法 利用雙乳化法合成PLGA-IR780-PFP,并用碳二亞胺法將靶向多肽cRGD連接于PLGA-IR780-PFP的表面,制備出靶向多功能納米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP)。檢測其一般性質(zhì)包括粒徑和電位等;對cRGD的靶向性進(jìn)行檢測;共聚焦顯微鏡下觀察B16細(xì)胞對納米粒的吞噬情況;繪制IR780的標(biāo)準(zhǔn)曲線并對cRGD-PLGA-IR780-PFP中IR780的包封率進(jìn)行計算;采用CCK-8法檢測不同濃度cRGD-PLGA-IR780-PFP、cRGD-PLGA-IR780和PLGA-IR780-PFP(三種納米粒中IR780的量一致)與B16細(xì)胞孵育24 h對細(xì)胞的毒性;將BALB/c老鼠隨機(jī)分為4組:對照組、注射cRGD-PLGA-IR780-PFP后1天組、7天組、15天組,尾靜脈注射cRGD-PLGA-IR780-PFP不同時間后對小鼠進(jìn)行眼球取血,將收集到的樣本進(jìn)行血常規(guī)和血生化分析。結(jié)果 成功制備的cRGD-PLGA-IR780-PFP大小約(255.83±5.46)nm,電位約(-0.55±0.037)mV;透射電鏡(TEM)及掃描電鏡(SEM)下其形態(tài)規(guī)則,大小均一;核磁共振氫譜(H-NMR)可見cRGD-PLGA和PLGA相比有明顯的多肽特征峰,共聚焦顯微鏡可見FITC的綠色熒光和DiI的紅色熒光完全重合,流式檢測cRGD的連接率高達(dá)98.06%;紫外分光光度計檢測cRGD-PLGA-IR780-PFP在780 nm波長處可見較強(qiáng)的吸收峰,根據(jù)IR780的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出包封率為(91.93±0.68)%;CCK-8法檢測三種納米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP、cRGD-PLGA-IR780和PLGA-IR780-PFP)對B16細(xì)胞無毒性作用;小鼠的血常規(guī)和血生化指標(biāo)顯示cRGD-PLGA-IR780-PFP無生物毒性作用。結(jié)論 成功制備出包載IR780和液態(tài)氟碳的靶向多功能納米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP),其大小均一、分散性好,與cRGD的連接率高,生物安全性好,為進(jìn)一步的多模態(tài)成像及光熱治療奠定了基礎(chǔ)。第二部分 載IR780靶向多功能納米粒多模態(tài)成像的研究目的 研究載IR780靶向多功能納米粒在體外和體內(nèi)增強(qiáng)超聲/光聲/近紅外熒光成像的能力。方法 體外超聲成像實(shí)驗(yàn)分為cRGD-PLGA-IR780-PFP不同濃度組,cRGD-PLGA-PFP組和生理鹽水組,各組均用808 nm激光輻照,觀察不同時間點(diǎn)的超聲顯像,并用光學(xué)顯微鏡觀察靶向納米粒相變的能力;體外光聲成像和近紅外熒光成像分別利用光聲成像儀及小動物活體成像儀觀察不同濃度的cRGD-PLGA-IR780-PFP體外光聲及熒光成像的能力并記錄相應(yīng)的光聲值和熒光值;體內(nèi)多模態(tài)成像實(shí)驗(yàn)分組為I:cRGDPLGA-IR780-PFP(靶向組)、II:PLGA-IR780-PFP(非靶向組)和III:生理鹽水(對照組),其中光聲成像是通過尾靜脈給黑色素瘤B16荷瘤小鼠分別注射I-III,近紅外熒光成像實(shí)驗(yàn)則通過尾靜脈注射I和II,然后對不同時間點(diǎn)(0、0.5、6、24 h)的各組小鼠進(jìn)行光聲或近紅外熒光成像并記錄相應(yīng)的光聲值和熒光值,并在24 h后對各組小鼠的離體器官和腫瘤進(jìn)行近紅外熒光成像并記錄熒光值;體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)是通過尾靜脈給黑色素瘤B16荷瘤小鼠注射I-III,6 h后通過808 nm激光輻照腫瘤,并對小鼠腫瘤進(jìn)行超聲成像并記錄腫瘤區(qū)域的灰階值。結(jié)果 cRGD-PLGA-IR780-PFP在體外增強(qiáng)了超聲/光聲/近紅外熒光成像。濃度越高時對應(yīng)的超聲灰階值越大,808 nm激光輻照5 min時達(dá)峰值,10 min后,隨著相變結(jié)束,各組灰階值降低,其相變過程可被光學(xué)顯微鏡監(jiān)測到。體外光聲成像顯示納米粒的光聲值與濃度成正比。體外熒光成像顯示隨著納米粒濃度(1-20 mg/ml)增加,熒光值逐漸升高,但超過20 mg/ml時會使熒光值降低。體內(nèi)光聲成像和近紅外熒光成像顯示小鼠注射納米粒6 h后靶向組腫瘤部位的光聲值及熒光值達(dá)最高,24 h后均降低,非靶向組和生理鹽水組24 h內(nèi)光聲值和熒光值均升高不明顯,24 h后對離體器官和腫瘤進(jìn)行近紅外熒光成像顯示靶向組腫瘤部位熒光值高于非靶向組。體內(nèi)超聲成像顯示在荷瘤小鼠注射納米粒6 h后,靶向組超聲成像顯著增強(qiáng),非靶向組和生理鹽水組未明顯增強(qiáng)。結(jié)論 制備的cRGD-PLGA-IR780-PFP在體外和體內(nèi)均可增強(qiáng)超聲/光聲/近紅外熒光成像,納米粒在激光的輻照下發(fā)生光致相變可增強(qiáng)體內(nèi)外超聲成像,IR780在近紅外區(qū)的強(qiáng)烈吸收峰可增強(qiáng)靶向多功能納米粒在體內(nèi)外光聲及近紅外熒光成像,且靶向納米粒于注射6 h后在腫瘤區(qū)域富集最多。第三部分 載IR780靶向多功能納米粒增強(qiáng)光熱治療的研究目的 研究靶向載IR780多功能納米粒(cRGD-PLGA-IR780-PFP)在體外及體內(nèi)增強(qiáng)光熱治療的能力。方法 將cRGD-PLGA-IR780-PFP稀釋為不同濃度組,通過近紅外熱成像儀檢測其在808 nm激光(2 W/cm2)輻照下的溫度變化,并檢測納米粒(5 mg/ml)在不同激光強(qiáng)度下的溫度變化;體外光熱治療實(shí)驗(yàn)分為:I、cRGD-PLGA-IR780-PFP,II、PLGA-IR780-PFP和III、cRGD-PLGAIR780,通過CCK-8試驗(yàn)研究不同納米粒在有無808 nm激光輻照時對B16細(xì)胞的生物毒性作用,并通過共聚焦顯微鏡研究I-III在有無808nm激光輻照時的細(xì)胞活性,以生理鹽水作為對照組;體內(nèi)對黑色素瘤B16荷瘤小鼠進(jìn)行光熱治療,實(shí)驗(yàn)分為1:cRGD-PLGA-IR780-PFP+NIR、2:PLGA-IR780-PFP+NIR;3:cRGD-PLGA-IR780+NIR,4:生理鹽水+NIR;5:cRGD-PLGA-IR780-PFP,6:生理鹽水6組,每組小鼠尾靜脈注射相同濃度納米粒,1-4組腫瘤給予激光輻照,整個輻照過程被近紅外熱成像儀監(jiān)控,在治療完成后觀察14天,并記錄腫瘤大小和小鼠體重的變化,同時對治療第2天的腫瘤進(jìn)行HE染色、PCNA及TUNEL檢測。結(jié)果 cRGD-PLGA-IR780-PFP在相同強(qiáng)度的激光輻照下的最大溫度呈濃度依賴性;在濃度相同時,激光強(qiáng)度越高,溫度上升越高。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示不同納米粒I-III在0-1 mg/ml濃度范圍內(nèi)對B16細(xì)胞是安全的。體外PTT實(shí)驗(yàn)提示靶向納米粒激光輻照組的治療效果最強(qiáng),說明PFP增強(qiáng)了納米粒的光熱作用。體內(nèi)的光熱實(shí)驗(yàn)顯示,靶向納米粒激光輻照組腫瘤溫度上升最高,在觀察期14天內(nèi)其腫瘤生長明顯受到抑制,通過腫瘤的HE染色,PCNA及TUNEL免疫組化檢測可見靶向納米粒激光輻照組的治療作用最明顯。結(jié)論 cRGD-PLGA-IR780-PFP在激光輻照下的光熱治療效果非常好,呈濃度依賴性和激光強(qiáng)度依賴性,且納米粒發(fā)生相變時可明顯增強(qiáng)其光熱治療效果。體內(nèi)光熱治療可顯著地抑制黑色素瘤的生長。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R943;R445
【部分圖文】：

圖 1.1 cRGD-PLGA-IR780-PFP 的合成示意圖。Fig.1.1 The composite diagram of cRGD-PLGA-IR780-PFP.圖 1.2cRGD-PLGA-IR780-PFP（a）和 PLGA-IR780-PFP（b）以（c）納米粒的水溶液。Fig1.2 The queous solutions of cRGD-PLGA-IR780-PFP (a), PLGcRGD-PLGA-PFP (c).

圖1.4cRGD-PLGA-IR780-PFP和PLGA-IR780-PFig 1.4 The mean potentials of cRGD-PLGA-IR780PFP nanoparticles.圖 1.5（a）cRGD-PLGA-IR780-PFP 的掃描電鏡圖IR780-PFP 的透射電鏡圖（標(biāo)尺為 0.2μm）。Fig 1.5 (a) The SEM image of cRGD-PLGA-IR780

Fig 1.4 The mean potentials of cRGD-PLGPFP nanoparticles.圖 1.5（a）cRGD-PLGA-IR780-PFP 的掃描IR780-PFP 的透射電鏡圖（標(biāo)尺為 0.2μmFig 1.5 (a) The SEM image of cRGD-PLGAiamges of cRGD-PLGA-IR780-PFP (scale
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本文編號：2886286