人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)是一種重要的蛋白酶,它可以特異性識(shí)別并切除DNA中的脫氧次黃嘌呤和各種烷基化嘌呤。hAAG在維持基因組完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,它參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡,并且和各種癌癥如肺癌和宮頸癌等息息相關(guān)。除此之外,hAAG能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生移碼突變和人體細(xì)胞中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定。因此,準(zhǔn)確并且靈敏檢測(cè)hAAG活性對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷都至關(guān)重要。為了提高檢測(cè)靈敏度,自20世紀(jì)90年代初以來(lái),已開發(fā)了多種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),并可用于多種不同目標(biāo)物的測(cè)定,如蛋白質(zhì),細(xì)胞,小分子和離子等。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相比,等溫核酸擴(kuò)增具有快速高效的特點(diǎn),可在簡(jiǎn)單條件下(如水浴)進(jìn)行,在恒定溫度下即可實(shí)現(xiàn)10~n倍的信號(hào)放大,對(duì)于低濃度疾病標(biāo)志物的檢測(cè)具有重要意義�；诖�,本論文在前人工作的基礎(chǔ)上,圍繞等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)hAAG開展了以下研究?jī)?nèi)容:第一章:主要介紹了DNA糖苷酶和常用的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù),并重點(diǎn)介紹了目前基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)DNA糖苷酶的方法。第二章:建立了一種簡(jiǎn)單的末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)激活的-核酸內(nèi)切酶IV(Endo IV)輔助的超分支信號(hào)擴(kuò)增方法靈敏檢測(cè)hAAG。該方法極其簡(jiǎn)單,整個(gè)反應(yīng)只需設(shè)計(jì)兩種核酸序列,反應(yīng)時(shí)間只需要~100 min。采用3'-NH_2修飾的發(fā)夾探針和信號(hào)探針抑制TdT激活的非特異性擴(kuò)增,使得反應(yīng)體系產(chǎn)生低的背景信號(hào),并且結(jié)合高效率的超分支擴(kuò)增技術(shù),該方法具有較高的靈敏度,檢測(cè)限為0.09032U/mL,線性范圍為0.1到50 U/mL,可以達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí),并可用于復(fù)雜HeLa細(xì)胞核提取物中hAAG的準(zhǔn)確檢測(cè)。該方法還可用于區(qū)分hAAG與其它DNA糖苷酶。第三章:發(fā)展了一種基于堿基切除修復(fù)調(diào)制的三重級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)增方法高靈敏檢測(cè)DNA糖苷酶。目標(biāo)物hAAG引發(fā)SDA反應(yīng),生成的產(chǎn)物作為引物觸發(fā)PG-RCA與基于Endo IV輔助的循環(huán)信號(hào)放大反應(yīng),利用三重級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)的高效率和UDG糖苷酶調(diào)制擴(kuò)增的低背景,該方法具有高的靈敏度,對(duì)于hAAG的測(cè)定,檢測(cè)限低至0.02612 U/mL。此外,該方法也可進(jìn)一步定量HeLa細(xì)胞提取物中hAAG的活性。第四章:建立了一種基于hAAG引發(fā)、TdT酶調(diào)制的合成CuNPs并無(wú)標(biāo)記檢測(cè)hAAG活性的熒光方法。TdT酶可以將dTTPs聚合添加到hAAG切割反應(yīng)產(chǎn)生的具有3'-OH末端的核酸上,形成聚T核酸序列,該序列可以與具有AP位點(diǎn)的輔助模板和輔助探針雜交形成穩(wěn)定的dsDNA,而Endo IV會(huì)切割dsDNA上的AP位點(diǎn),繼續(xù)產(chǎn)生具有3'-OH末端的核酸。在TdT酶和Endo IV的共同作用下,整個(gè)反應(yīng)反復(fù)循環(huán),最終產(chǎn)生大量的聚T核酸序列。最后,以聚T核酸序列為模板合成具有熒光信號(hào)的CuNPs并定量檢測(cè)hAAG的活性。與之前通過(guò)熒光試劑和猝滅劑標(biāo)記的方法相比,該方法無(wú)需標(biāo)記,成本低,穩(wěn)定性好,并且具有良好的選擇性。第五章:結(jié)論。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R440
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 綜述
    1.1 前言
    1.2 堿基切除修復(fù)反應(yīng)
    1.3 DNA糖苷酶
    1.4 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)
        1.4.1 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（SDA）
        1.4.2 指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)（EXPAR）
        1.4.3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA）
        1.4.4 雜交鏈反應(yīng)（HCR）
        1.4.5 級(jí)聯(lián)放大技術(shù)
        1.4.6 等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用
    1.5 基于等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)DNA糖苷酶
        1.5.1 比色法
        1.5.2 熒光法
        1.5.3 生物發(fā)光法
        1.5.4 電化學(xué)法
    1.6 選題思路和主要研究?jī)?nèi)容
第二章 靶向調(diào)制的超支化擴(kuò)增檢測(cè)HeLa細(xì)胞中的人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 試劑和材料
        2.2.2 hAAG活性檢測(cè)方法
        2.2.3 凝膠電泳分析
        2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞核提取物的制備
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 設(shè)計(jì)原理
        2.3.2 可行性分析
        2.3.3 條件優(yōu)化
        2.3.4 hAAG活性分析
        2.3.5 選擇性分析
        2.3.6 實(shí)際樣品分析
    2.4 結(jié)論
第三章 堿基切除修復(fù)調(diào)制的三重級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)增高靈敏檢測(cè)人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 試劑和材料
        3.2.2 DNA儲(chǔ)備液的制備
        3.2.3 hAAG活性檢測(cè)方法
        3.2.4 凝膠電泳分析
        3.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞核提取物的制備
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 設(shè)計(jì)原理
        3.3.2 可行性分析
        3.3.3 條件的優(yōu)化
        3.3.4 hAAG活性分析
        3.3.5 選擇性分析
        3.3.6 實(shí)際樣品分析
    3.4 結(jié)論
第四章 基于目標(biāo)物引發(fā)的熒光CuNPs的合成無(wú)標(biāo)記檢測(cè)人類烷基腺嘌呤DNA糖苷酶
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 試劑和材料
        4.2.2 DNA儲(chǔ)備液的制備
        4.2.3 hAAG活性檢測(cè)方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 設(shè)計(jì)原理
        4.3.2 可行性分析
        4.3.3 條件優(yōu)化
        4.3.4 hAAG活性分析
        4.3.5 選擇性分析
    4.4 結(jié)論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
在學(xué)期間的研究成果
致謝

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 岑夫子;;制造前所未有的生命[J];風(fēng)流一代;2019年23期

2 劉濤;;關(guān)于幾種植物材料DNA含量差異性的研究[J];中學(xué)生物學(xué);2019年03期

3 陳從周;;DNA折紙術(shù)——全編程的信息工具[J];廣州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2019年01期

4 Jiaojiao Zhang;Feng Li;Dayong Yang;;DNA: From Carrier of Genetic Information to Polymeric Materials[J];Transactions of Tianjin University;2019年04期

5 李文送;;DNA甲基化及其生物學(xué)功能[J];生物學(xué)教學(xué);2014年09期

6 劉慶華;茹慧香;;“DNA是主要的遺傳物質(zhì)”教學(xué)設(shè)計(jì)[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年07期

7 丁思思;袁華;羅小虎;李高峰;;植物DNA粗提取與鑒定的簡(jiǎn)便方法[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年19期

8 周苑;;《DNA分子的結(jié)構(gòu)》微課程設(shè)計(jì)[J];中國(guó)信息技術(shù)教育;2016年24期

9 吳久宏;;追尋人類思維的脈絡(luò)——蘇教版“DNA分子的結(jié)構(gòu)”一節(jié)科學(xué)史料教學(xué)設(shè)計(jì)[J];中學(xué)生物教學(xué);2016年21期

10 唐琳;;《DNA是主要的遺傳物質(zhì)》教學(xué)設(shè)計(jì)(第一課時(shí))[J];課程教育研究;2016年35期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 閆閃閃;不同DNA識(shí)別信號(hào)通路在結(jié)核桿菌感染過(guò)程中的相互調(diào)控研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2019年

2 許琳;農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素DNA誘導(dǎo)組裝與多色免疫快速檢測(cè)方法研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 劉永振;雞馬立克氏病病毒調(diào)控DNA受體信號(hào)通路逃避宿主天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

4 孫玉蝶;基于DNA放大的光學(xué)傳感器在檢測(cè)心梗相關(guān)核酸標(biāo)志物中的應(yīng)用研究[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2019年

5 Sadaruddin Chachar;C3植物秈、粳水稻光合作用相關(guān)基因及其與DNA甲基化關(guān)系的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

6 李昺之;基于DNA-銀納米簇的轉(zhuǎn)錄因子熒光傳感體系的構(gòu)建及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

7 白銀亮;四種新型氧釩配合物的制備、DNA鍵合作用及體外體內(nèi)抗腫瘤活性研究[D];蘭州大學(xué);2019年

8 楊艷;細(xì)菌DNA硫修飾的抗逆寬泛性及清除過(guò)氧化氫的機(jī)制研究[D];上海交通大學(xué);2017年

9 戴道鳳;變鉛青鏈霉菌DNA硫修飾的抗氧化功能探索[D];上海交通大學(xué);2017年

10 李佳倫;USP7負(fù)調(diào)控DNA甲基化的機(jī)制和功能研究[D];華東師范大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 黃燚燚;氯化兩面針堿阻斷Top I抑制劑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的作用及機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 藍(lán)富;蘆薈大黃素α-氨基膦酸酯衍生物的合成及其與DNA相互作用研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

3 唐正秀;門診男性精子DNA碎片指數(shù)與體外受精—胚胎移植的相關(guān)參數(shù)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

4 陳潤(rùn);適配體特異性修飾DNA納米治療系統(tǒng)抗腫瘤作用研究[D];鄭州大學(xué);2019年

5 徐雪雪;釕配合物與G-四鏈體DNA及酵母RNA的相互作用研究[D];河北大學(xué);2019年

6 陳熙;東亞雀形目鳥類DNA條形碼研究[D];西南林業(yè)大學(xué);2018年

7 李崢;硅藻DNA條形碼及微單倍型的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2019年

8 梁春燕;碳點(diǎn)的可控制備及其與DNA/蛋白質(zhì)的相互作用[D];湖北師范大學(xué);2019年

9 李天楚;幾種常見節(jié)肢動(dòng)物種群內(nèi)DNA條形碼變異[D];河北大學(xué);2019年

10 王夢(mèng)曦;人源ARH3-ADPR復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)與功能研究[D];河北大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2878828