目的:異質性耐藥(Heteroresistance,HR)是指同一遺傳背景下不同克隆亞群對抗生素敏感性各不相同的現象,作為耐藥的一種特殊形式,異質性耐藥被認為是細菌由敏感狀態(tài)發(fā)展至耐藥狀態(tài)的中間階段。本研究通過分析肺炎克雷伯菌對頭孢吡肟(Cefepime-heteroresistant-Klebsiella pneumoniae,FEP-HR-KP)和厄他培南(Ertapenem-heteroresistant-Klebsiella pneumoniae,ETP-HR-KP)異質性耐藥的臨床特征、臨床轉歸與獨立危險因素,以及大腸埃希菌對碳青霉烯類抗生素異質性耐藥(Carbapenem heteroresistanc Escherichia coli,CHEC)的分子機制,為臨床治療提供相關理論依據和防控措施。方法:收集2014年1月至2015年12月從重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院患者無菌體液標本中分離的108株肺炎克雷伯菌進行回顧性病例對照研究,先用紙片擴散法(Kirby-Bauer disk diffusion test,K-B法)和E-test法進行異質性耐藥表型的初篩,進而用菌落譜型分析(Population Analysis Profile,PAP法)進行異質性耐藥的確證;脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)進行菌株同源性檢測及分子流行病學特征分析;統(tǒng)計分析2年內FEP-HR-KP和ETP-HR-KP臨床特征,隨后統(tǒng)計臨床病例資料并運用SPSS.21軟件分析FEP-HR-KP和ETP-HR-KP菌感染的相關獨立危險因素。另外,針對研究中發(fā)現的一個特殊病例,先用K-B法和PAP實驗對異質性耐藥表型初篩和確認,PCR(Polymerase chain reaction)法檢測碳青霉烯耐藥相關基因,從體內和體外兩個方面比較三株菌毒力大小;用第二代測序技術對三株菌進行全基因組測序,從基因層面闡明了三株菌的相關信息,完成外排泵相關基因SNP突變位點驗證。結果:1、肺炎克雷伯菌對頭孢吡肟和厄他培南異質性耐藥的流行病學及危險因素研究結果如下:(1)K-B法和E-test法發(fā)現FEP-HR-KP和ETP-HR-KP并經PAP實驗確認。(2)PFGE結果顯示,異質性耐藥菌株原始菌和克隆亞群的條帶一致,沒有差異,遺傳學上具有高度的同源關系,可認為是相同的菌株;而收集的臨床菌株之間的PFGE條帶各不相同,兩兩之間均存在7條條帶以上的差異,菌株之間不存在暴發(fā)流行。(3)肺炎克雷伯菌對FEP的藥敏結果分布情況為:異質性耐藥菌株共有51株(51/108,47.2%),敏感菌株共有29株(29/108,26.9%),中介菌株共有3株(3/108,2.8%),耐藥菌株共有25株(25/108,23.1%);肺炎克雷伯菌對ETP的藥敏結果分布情況為:異質性耐藥菌株共有63株(63/108,58.3%),敏感菌株共有16株(16/108,14.8%),中介菌株共有4株(4/108,3.7%),耐藥菌株共有25株(25/108,23.2%)。進一步分析從2014年到2015年的整體異質性耐藥率,菌株對ETP的異質性耐藥率58.3%(63/108)高于FEP的47.2%(51/108),且FEP和ETP的異質性耐藥率逐年增加。肺炎克雷伯菌主要分離自血液標本(36/108,33.3%),且超過一半的標本都來自于外科(70/108,64.8%)。(4)危險因素分析結果顯示軟組織感染(OR:1.92,95%CI:0.91-3.91,P=0.049)、機械通氣(OR:2.45,95%CI:1.31-4.47,P=0.013)、頭孢菌素類抗生素使用(OR:2.10,95%CI:1.18-3.13,P=0.020)是引起FEP-HR-KP相關感染的獨立危險因素(P0.05);頭孢類抗生素使用(OR:2.08,95%CI:0.96-4.20,P=0.033)、內置引流管(OR:2.76,95%CI:1.49-4.90,P=0.018)、碳青霉烯類抗生素使用(OR:2.52,95%CI:1.08-3.86,P=0.023)是引起ETP-HR-KP相關感染的獨立危險因素(P0.05)。2、大腸埃希菌碳青霉烯異質性耐藥機制研究結果如下:(1)統(tǒng)計三株菌的藥敏信息,K-B法初篩異質性耐藥表型然后用PAP實驗確認,證實1001為敏感菌,1021為異質性耐藥菌,88為耐藥菌。(2)耐藥相關基因檢測結果顯示1001號菌表達bla_(CTX-M-14)基因,1021號菌表達bla_(CTX-M-14)、bla_(CMY-42)基因,88號菌表達bla_(CTX-M-15)、bla_(CMY-42)、bla_(OXA-1)基因,均沒有檢測出碳青霉烯酶基因和AmpC基因,也沒有膜孔蛋白缺失。3株菌在體外和體內的毒力大小結果是一致的,即1021號菌毒力最強,1001號菌其次,88號菌毒力最弱。(3)SNP突變位點驗證結果顯示異質性耐藥菌株在acrA基因上存在D80L(第80位由天冬氨酸變?yōu)榱涟彼?和S81Q(第81位由絲氨酸變?yōu)楣弱０?的氨基酸替換現象,marA基因上存在T50W(第50位由蘇氨酸變?yōu)樯彼?的氨基酸替換現象,在acrR基因上存在L97E(第97位由亮氨酸變?yōu)楣劝彼?的氨基酸替換現象,在soxR基因上存在V57H(第57位由纈氨酸變?yōu)榻M氨酸)的氨基酸替換現象。結論:異質性耐藥是耐藥的一種特殊形式,普遍存在于各類細菌對各類抗生素的耐藥之中。肺炎克雷伯菌對頭孢吡肟和厄他培南異質性耐藥相關研究結果提示侵入性操作和長期抗生素治療史會增加患者感染該類異質性耐藥菌株的風險,因此,減少不必要的侵入性操作并采用多種抗生素短期結合治療是防控該類菌株產生的有效措施。另外,目前國內外對于異質性耐藥的研究較少,機制尚不清楚,本研究中大腸埃希菌碳青霉烯異質性耐藥相關機制可能有以下幾種:1、產ESBLs相關基因的表達可能與大腸埃希菌對碳青霉烯異質性耐藥有關。2、外排泵相關基因突變可能是CHEC菌株從敏感到異質性耐藥最終進化為耐藥的機制。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

3.1 異質性耐藥菌株的初篩K-B藥敏紙片法和E-test實驗顯示，抑菌圈內有散在的菌落生長，說明各細菌亞群對FEP和ETP敏感程度不一，可初步判定為異質性耐藥，見圖1.1和圖1.2。a b圖1.1 肺炎克雷伯菌FEP和ETP的K-B法結果Figure1.1 K-B test result of FEP and ETP in K. pneumoniae

19a b圖1.2 肺炎克雷伯菌FEP和ETP的E-test法結果Figure1.2 E-test result of FEP and ETP in K. pneumoniae3.2 異質性耐藥菌株的 PAP 確認PAP實驗是判斷異質性耐藥菌株的金標準，如果細菌生長的最高非抑菌抗生素濃度與最低完全抑菌抗生素濃度差異大于8倍，則可以確認為異質性耐藥現象。以FEP為例，如圖1.2所示：完全敏感菌8010在最低抑菌濃度2μg/ml附近迅速被殺滅，無菌落生長；完全耐藥菌8007在藥物濃度為128μg/ml之前都保持比較穩(wěn)定的狀態(tài)，在最低抑菌濃度曲線突然下降，無菌落生長；而8023、8027、8038、8039、8014這5株異質性耐藥菌株的曲線則緩慢下降，且最高非抑菌抗生素濃度與最低完全抑菌抗生素濃度差異大于8倍。a b圖1.3 肺炎克雷伯菌FEP和ETP的PAP?

肺炎克雷伯菌FEP和ETP的PAP曲線圖
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 孫靜娜;董威;趙帥;王國欣;劉澤世;張征;;CCCP泵抑制劑對多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌作用的研究[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2014年21期

2 孫繼德;付雙雙;黃世峰;徐繡宇;張莉萍;;無菌體液中大腸埃希菌對頭孢吡肟耐藥的危險因素分析[J];第三軍醫(yī)大學學報;2014年19期

本文編號：2877245