基因治療是一種通過編輯細胞內(nèi)基因或引入外源治病基因,從根本上實現(xiàn)對疾病治療的方法。然而,這一理念的實現(xiàn)需要突破復雜的組織及細胞屏障將基因遞送到細胞中,并在不破壞機體正常功能的條件下表達出治療分子。此外,普通的化學藥物治療需要足夠的血藥濃度才能達到治療目的,相似地,基因治療的實現(xiàn)也需基因遞送到足夠多的靶細胞中,以實現(xiàn)治病目的。在過去的近30年時間里,臨床基因治療被用于遺傳性疾病、癌癥、慢性傳染病等的治療。相當數(shù)量的臨床Ⅰ/Ⅱ期實驗證明了基因治療方法對于一些危重大疾病包括遺傳性血液病、神經(jīng)及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病等具有突出的療效。鑒于基因治療實現(xiàn)的藥物“核酸”在體內(nèi)易降解,這些治療都利用了載體構(gòu)建出遞送系統(tǒng)的技術(shù)來實現(xiàn)。有效的基因治療與低毒、高效的基因載體密不可分。鑒于病毒性基因載體具有免疫原性等諸多缺陷,非病毒性基因載體以勢不可擋的姿態(tài)進入了科學家的視野。而在不同類型、不同遞送原理的非病毒類載體中,研究最為廣泛的是陽離子基因載體。以此為基礎(chǔ)的遞送系統(tǒng)更加多樣和安全,但與病毒性載體相比,其效率還有很大的提升空間。目前的基因遞送系統(tǒng)研究更多的集中在提高細胞吞噬率這一點,事實上,基因的表達受到諸多因素的影響,包括細胞質(zhì)內(nèi)基因的穩(wěn)定存在,以及內(nèi)涵體逃逸以后,細胞內(nèi)基因順利釋放并表達。本論文主要以來源廣泛、相容性好、可降解的生物分子為基礎(chǔ),致力于通過組裝這一非共價鍵連接的方式,設(shè)計制備出既具有較高的吞噬率、又具有核酸釋放促進功能的陽離子聚合物基因藥物遞送系統(tǒng)。首先,我們選取聚天冬氨酸這一低毒、生物可降解、生物相容性好的聚合物,設(shè)計合成了環(huán)糊精-苯環(huán)主客體組裝超分子,用于基因遞送系統(tǒng)的研究。我們分別制備了星型、以環(huán)糊精為核的基于聚天冬氨酸的聚陽離子,以及帶有苯環(huán)側(cè)鏈基團的線型聚天冬氨酸骨架。通過環(huán)糊精與苯環(huán)的主-客體組裝,將星型聚陽離子與線型骨架組裝在一起,得到一系列可作為基因治療遞送系統(tǒng)使用的基于聚天冬氨酸的具有生物可降解性的超分子組裝體。制備得到的超分子組裝體表現(xiàn)出良好的降解性、較高的核酸縮合能力,較低的細胞毒性。更重要的是,在不同的材料(N)/核酸(P)比例下,超分子組裝體介導的基因轉(zhuǎn)染效率明顯高于其主-客體組裝中的主體,即環(huán)糊精的星型聚天冬氨酸聚陽離子衍生物。除此之外,通過自殺基因治療體系進行的體外抗癌實驗,也進一步證實了組裝體的高效率。這一研究為設(shè)計制備可降解超分子藥物遞送系統(tǒng)提供了新的思路和方法。其次,我們在組裝結(jié)構(gòu)設(shè)計促進基因轉(zhuǎn)染效率的基礎(chǔ)上,嘗試引入具有更強電荷競爭力的肝素,進一步促進核酸釋放,提高組裝遞送系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)染效率。肝素,作為一種具有高密度的負電荷的多糖,通過“graft onto”等化學修飾手段,在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。但由于肝素單一的溶解性,極大的限制了其化學改性,進而限制了其應用領(lǐng)域。在本工作中,我們首先報道了一種改性肝素溶解性的方法,即通過引入四丁基銨組分將肝素由水溶性改性成油/水兩親性以用于進一步化學修飾。隨后,我們通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)反應合成了一系列肝素為骨架的梳型共聚物,并通過組裝形成了包含肝素的凝膠結(jié)構(gòu)型聚合物納米顆粒。我們測試了這些納米顆粒的pDNA縮合能力、細胞毒性以及轉(zhuǎn)染能力,并與已報道的基因載體相比較。這些納米顆粒被證實具有高轉(zhuǎn)染和低毒性,是有效的基因遞送系統(tǒng)。證明了將可降解肝素負電性生物分子引入進入基因載體,可以在保證轉(zhuǎn)染效率的同時,有效的降低載體毒性。同時,我們也證實了,通過改性肝素的溶解性,進而對其進行聚合物接枝修飾和功能化以拓寬其應用是可以實現(xiàn)的。我們的研究也為拓寬肝素化學改性方式及應用領(lǐng)域提供了基礎(chǔ)。最后,我們基于肝素溶解性的改性手段,設(shè)計合成了一種新型低毒性核-殼結(jié)構(gòu)的納米組裝體(Hep@PGEA)。這種組裝體帶有可解鎖的負電性肝素核心(HepNP),通過還原響應解鎖,釋放后的肝素與外層殼結(jié)構(gòu)中的陽離子聚合物PGEA作用,促進其中縮合的核酸的釋放。除此之外,作為一種眾所周知的負電性多糖,具有豐富的磺酸基團,除了與陽離子發(fā)生較強的相互作用,還具有促進血管生成、抗凝、抗炎等作用,對心血管疾病具有重要意義。Hep@PGEA被證實對miRNA和pDNA都可以實現(xiàn)高效遞送,并通過分別遞送功能核酸實現(xiàn)了針對心梗這一典型心血管疾病模型的高效基因治療。同時,我們通過實驗證實,隨心梗的發(fā)展,心臟組織中谷胱甘肽(GSH)含量呈升高趨勢,有利于還原解鎖Hep@PGEA載體系統(tǒng)中NA的釋放。隨后,我們提出了分階段遞送的治療方法,通過Hep@PGEA對miR-499和pVEGF的分階段遞送,實現(xiàn)了在心梗初期時抑制心肌細胞凋亡、降低心臟損傷,隨后促進血管再生、恢復心臟血供的分步的體系化治療。這一分階段核酸遞送在保持和恢復缺血后心臟功能,減小梗死面積、促進血管再生以及抑制心肌細胞肥大方面取得了令人驚喜的結(jié)果。除此之外,由于生物還原劑在生物體的廣泛存在,我們提出的可解鎖肝素組裝納米復合體以及分階段治療策略也將為其他危重疾病提供新的方法和思路。綜上所述,我們以可降解、生物相容性好的聚天冬氨酸或肝素多糖為基礎(chǔ),結(jié)合組裝和原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的方法,制備出較低毒性、可以促進核酸釋放的陽離子聚合物基因載體,實現(xiàn)高效地基因遞送和表達,對構(gòu)建新型多功能基因遞送體系具有重要意義,也為腫瘤、心血管疾病的治療提供了新方法、新思路。
【學位單位】：北京化工大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R450
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 生物分子及其在藥物遞送中的應用
        1.1.1 聚天冬氨酸
            1.1.1.1 聚天冬氨酸作為靶向分子的載藥釋放體系
            1.1.1.2 聚天冬氨酸作為載體組分的載藥釋放體系
        1.1.2 肝素
            1.1.2.1 肝素作為藥物的載藥釋放體系
            1.1.2.2 肝素作為載體組分的載藥遞送體系
    1.2 基因治療與陽離子聚合物遞送體系
        1.2.1 陽離子聚合物遞送體系
        1.2.2 陽離子聚合物在組織工程支架中的應用
        1.2.3 陽離子聚合物在藥物遞送中的應用
    1.3 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）
    1.4 組裝（assembly）在功能性生物材料合成中的應用
    1.5 課題的目的及意義
第二章 環(huán)糊精-苯環(huán)主客體組裝基因遞送系統(tǒng)
    2.1 前言
    2.2 實驗部分
        2.2.1 實驗原料與試劑
        2.2.2 實驗儀器與設(shè)備
        2.2.3 基因載體的合成
2）'>            2.2.3.1 合成氨基修飾的環(huán)糊精（CD-NH₂）
            2.2.3.2 線型、星型聚天冬氨酸β-芐酯（PBLA、CD-PBLA）的制備
            2.2.3.3 線型聚天冬氨酸β-芐酯部分羥基化
            2.2.3.4 星型聚天冬氨酸β-芐酯氨基化
            2.2.3.5 CD-PAsp-DET與PAsp-EA-BLA的主-客體組裝
        2.2.4 聚合物的表征
        2.2.5 聚合物/pDNA復合物的表征
        2.2.6 細胞毒性
        2.2.7 體外轉(zhuǎn)染實驗
        2.2.8 細胞內(nèi)吞效率檢測
        2.2.9 自殺基因轉(zhuǎn)染測試
        2.2.10 統(tǒng)計學分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 基于聚天冬氨酸的載體材料的合成與降解
        2.3.2 聚合物/pDNA復合物的生物物理表征
        2.3.3 細胞毒性
        2.3.4 基因轉(zhuǎn)染實驗
        2.3.5 細胞內(nèi)吞實驗
        2.3.6 5-FC/ECD體系體外抑瘤實驗
    2.4 小結(jié)
第三章 肝素梳型共聚物及其組裝基因遞送系統(tǒng)
    3.1 前言
    3.2 實驗部分
        3.2.1 實驗原料與試劑
        3.2.2 實驗儀器與設(shè)備
        3.2.3 兩親性肝素（HepTBA）的制備
        3.2.4 制備基于肝素的ATRP大分子引發(fā)劑（Hep-Br）
        3.2.5 通過ATRP對肝素進行接枝修飾
        3.2.6 聚合物表征
        3.2.7 聚合物納米顆粒的表征
        3.2.8 聚合物/pDNA復合物的表征
        3.2.9 體外細胞毒性實驗
        3.2.10 體外轉(zhuǎn)染實驗
        3.2.11 統(tǒng)計學分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 可油溶肝素鹽（HepTBA）的制備與表征
        3.3.2 肝素大分子引發(fā)劑（Hep-Br）的制備與表征
        3.3.3 通過ATRP將PEGMEMA接枝修飾到肝素上
        3.3.4 通過ATRP將DMAEMA修飾到肝素基聚合物上
        3.3.5 聚合物/pDNA復合物的表征
        3.3.6 細胞毒性實驗
        3.3.7 體外基因轉(zhuǎn)染實驗
    3.4 小結(jié)
第四章 可解鎖組裝核-殼結(jié)構(gòu)核酸自促釋放型基因遞送系統(tǒng)
    4.1 前言
    4.2 實驗部分
        4.2.1 實驗原料與試劑
        4.2.2 實驗儀器與設(shè)備
        4.2.3 肝素核-殼組裝納米顆粒載體材料的制備及表征
        4.2.4 肝素核-殼組裝納米復合體的基因縮合能力檢測
        4.2.5 細胞毒性和吞噬率檢測
        4.2.6 miR-499和pVEGF功能核酸的體外基因遞送
        4.2.7 miR-499和pVEGF功能核酸的體內(nèi)基因治療
        4.2.8 統(tǒng)計學分析
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 Hep@PGEA納米組裝體的制備與表征
        4.3.2 Hep@PGEA/NA復合體表征
        4.3.3 細胞存活率和細胞吞噬率
        4.3.4 體內(nèi)聚集實驗
        4.3.5 基于miR-499功能核酸的基因治療
        4.3.6 基于pVEGF功能核酸的基因治療
        4.3.7 基于miR-499和pVEGF功能核酸的新型分階段心�；蛑委�
    4.4 小結(jié)
第五章 結(jié)論
參考文獻
致謝
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附件

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本文編號：2871719