目的萬古霉素中介金葡菌(VISA)和異質性萬古霉素中介金葡菌(h-VISA)通常伴有毒力和生物膜等多個生物學表型特征的改變,這些變化可使細菌在體內長期存活,導致感染反復發(fā)作。Vra SR是金葡菌萬古霉素耐藥相關二元調控系統(tǒng)。有研究顯示,vra SR的表達水平在h VISA/VISA中明顯上升。通過前期研究,我們發(fā)現(xiàn)Vra R蛋白可直接與金葡菌全局調控子agr啟動子區(qū)域結合,提示Vra SR可能具有廣泛的調控作用。本文重點探討Vra SR在h VISA/VISA致病性中發(fā)揮的作用,以期為基于Vra SR的h VISA/VISA感染診斷和臨床治療提供理論依據(jù)。方法(1)利用基因敲除及基因回補技術構建異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌標準菌株(Mu3)vra SR基因敲除株(Δvra SR)及基因回補株(CΔvra SR),采用q RT-PCR驗證構建是否成功。(2)生物表型研究:用分光光度計檢測金黃色葡萄球菌的生長情況,繪制生長曲線;E-test方法檢測萬古霉素MIC值;稀釋法定量檢測溶血素活力和凝固酶活力;通過電子顯微鏡觀察細菌細胞壁厚度;與人宮頸癌上皮細胞共培養(yǎng)觀察細菌粘附能力;微孔板成膜法和激光共聚焦顯微鏡法檢測細菌的生物膜形成能力;體外中性粒細胞吞噬及殺傷實驗檢測細菌抗吞噬及抗殺菌能力。q RT-PCR的方法檢測粘附相關基因(fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi)、細胞壁合成相關基因(cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D)的轉錄水平。結果1.成功構建vraSR基因敲除株及其回補株,q RT-PCR證實ΔvraSR中vraSR基因的轉錄完全缺失,對Δvra SR的質粒回補回復了vra SR基因的轉錄。2.Mu3中vra SR基因的缺失對金葡菌生物表型的影響:(1)與Mu3相比,Δvra SR對金葡菌的生長未造成明顯影響;(2)Mu3、Δvra SR和CΔvra SR萬古霉素MIC值分別為1.5μg/ml、0.38μg/ml、1.5μg/ml,與Mu3相比,Δvra SR菌株萬古霉素MIC值下降了3.95倍。CΔvra SR株能回復萬古霉素的MIC值;(3)Δvra SR與Mu3相比溶血素活力和凝固酶活力無統(tǒng)計學差異(P0.05);(4)Δvra SR菌株細胞壁合成能力下降,Mu3和Δvra SR細胞壁平均厚度分別為18.53±2.84 nm和26.64±3.07nm(p0.01).CΔvra SR株能回復細胞壁合成能力,其細胞壁平均厚度為23.32±3.59 nm(p0.01);(5)與Mu3相比,Δvra SR粘附He La細胞的能力降低(LOG10 CFU/ml,5.75±0.43 Vs 3.53±0.71,p0.01),CΔvra SR能回復對Hela細胞的黏附能力(LOG10CFU/ml5.20±0.36,p0.05)。(6)Δvra SR菌株生物膜合成能力下降,Mu3和Δvra SR生物膜平均厚度分別為7.38±1.4μm Vs 14.44±1.65μm,(p0.001)。CΔvra SR能回復生物膜的合成能力(9.35±1.37μm,p0.01)(7)與Mu3相比,Δvra SR更易被中性粒細胞吞噬和殺傷,Mu3與Δvra SR吞噬率分別為47.75±2.56%和71.29±2.55%(p0.001),吞噬指數(shù)分別為1.65±0.16和3.11±0.32(p0.01),在中性粒細胞中細菌的存活量分別為5.56±0.63 Vs 2.73±0.50(LOG10 CFU/ml)(p0.001)。(8)與Mu3相比,Δvra SR菌株中粘附相關基因fnb A,fnb B,clf A,ebps,sbi和細胞壁合成相關基因cap5K,cap5N,nan A,tag A,mur D的轉錄水平均表現(xiàn)為下調,且差異有顯著性(p0.05),CΔvra SR株能回復黏附基因和細胞壁合成相關基因的表達。結論二元調控系統(tǒng)Vra SR在h VISA/VISA致病性中發(fā)揮重要作用。Vra SR可以增加金葡菌對萬古霉素的耐藥,促進金葡菌粘附上皮細胞及合成細胞壁、增強生物膜形成。增強金葡菌抵抗人中性粒細胞的吞噬及殺菌,協(xié)助金葡菌逃避人免疫系統(tǒng)的攻擊,有利于其在體內的生存。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

3 結果3.1 金葡菌 Mu3 中 vraSR 基因的敲除及回補圖1A是Mu3與vraSR基因敲除株ΔvraSR基因組DNA以vraSR-IF和vraSR-IR為引物的 pcr 結果，以 Mu3 為模板，擴增 PCR 產物長度為 1755bp，以 vraSR 基因

圖 2 Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR 菌株生長曲線Fig 2. The growth curve of Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR strainsvraSR 基因降低金葡菌對萬古霉素耐藥顯示 Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR 菌株萬古霉素 MIC 值分別為 1.5μg、1.5μg/ml。與 Mu3 相比，ΔvraSR 菌株萬古霉素 MIC 值下降了 3株能回復萬古霉素的 MIC 值。以上結果說明 VraSR 增加金葡菌對。

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文圖 3 Mu3、ΔvraSR、CΔvraSR E-test 結果Fig 3. The MIC of Mu3、ΔvraSR and CΔvraSR strains除 vraSR 基因對金葡菌溶血素活力無明顯影響圖 4 顯示 Mu3 與ΔvraSR 菌株溶血素活力無明顯差異（P＞0.05）。該結果raSR 對金葡菌溶血素活力無明顯影響。
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相關碩士學位論文 前1條

1 高彩虹;萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌二元調控系統(tǒng)VraSR在細菌致病性中的作用研究[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

本文編號：2871322