基因治療是最有希望治愈惡性腫瘤的方法之一,其中基因載體的開發(fā)是核心,而具有基因遞送和生物成像的雙功能載體是一個重要的發(fā)展方向。稀土上轉(zhuǎn)換納米晶(UCNPs)是一種新型的熒光探針,在生物醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用前景。據(jù)此,本研究使用陽離子三肽類脂包覆β-NaYF4:Yb3+,Er3+上轉(zhuǎn)換納米晶構(gòu)建雙功能復(fù)合基因載體,進(jìn)行基因遞送和生物成像性能研究。使用高溫油相法,以稀土氯化物(YCl3·6H2O,YbCl3·6H2O,ErCl3 6H2O)為原料,油酸(OA)為表面活性劑,1-十八烯(ODE)為反應(yīng)溶劑,合成Yb3+、Er3+摻雜的β-NaYF4:Yb3+,Er3+。通過X射線衍射(XRD)、掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)等表征手段,進(jìn)一步篩選出粒徑均勻,符合生物應(yīng)用的β-NaYF4:Yb3+,Er3+納米晶,其制備最佳條件:反應(yīng)3h,300℃,稀土氯化物、OA、NaOH和NH4HF2的摩爾比為 1:19:2.5:2.5。通過薄膜分散法和超聲分散法相結(jié)合的方式,將陽離子三肽類脂(CD014)包覆到β-NaYF4:Yb3+,Er3+上轉(zhuǎn)換納米晶表面,構(gòu)建復(fù)合納米基因載體β-NaYF4:Yb3+,Er3+@CD014(CSLNs)。通過激光粒度儀和透射電子顯微鏡對所構(gòu)建的CSLNs的粒徑和微觀形貌進(jìn)行了表征,結(jié)果表明CSLNs呈球形結(jié)構(gòu),粒徑均勻且尺寸在50 nm左右;CSLNs粒子Zeta電位為+80 mV。瓊脂糖凝膠電泳實驗表明,在CSLNs與Luc-siRNA質(zhì)量比大于4/1時,Luc-siRNA被完全延滯,CSLNs與Luc-siRNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。以CSLNs為基因運載工具,對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞攝入、介導(dǎo)Luc-siRNA的沉默效率等體外基因遞送研究。結(jié)果表明,在CSLNs與Luc-siRNA質(zhì)量比大于3/1時,對A549、HeLa、NCI-H460和Heβ-2等細(xì)胞株的攝入率均達(dá)到75%以上,高于商品試劑DOTAP和Liβofectamine 2000;通過透射電子顯微鏡檢測超薄細(xì)胞切片,轉(zhuǎn)染30 min后觀察到CSLNs有效地進(jìn)入A549細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染4h后,可清晰地觀察到六邊形上轉(zhuǎn)換納米晶。通過CSLNs運載Luc-siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,對熒光素酶基因的沉默率最高達(dá)60%,與商品轉(zhuǎn)染試劑DOTAP和Liβofectamine 2000相當(dāng)。使用CSLNs對A549細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,檢測多種腫瘤細(xì)胞株的上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像。在980 nm激光激發(fā)下,熒光顯微鏡檢測到CSLNs在胞內(nèi)發(fā)出明亮的黃綠色熒光,實現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換熒光成像,可作為腫瘤細(xì)胞的熒光標(biāo)記,同時也證明CSLNs可有效進(jìn)入細(xì)胞。使用熒光光譜儀檢測A549細(xì)胞裂解液的上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度,熒光譜圖中顯示上轉(zhuǎn)換納米材料中Er3+的特征峰,與細(xì)胞成像時獲得明亮的黃綠色熒光結(jié)果相一致。為了建立荷瘤小鼠模型,選用BALB/c-nude小鼠在其皮下接種高表達(dá)熒光素酶的A549細(xì)胞。通過尾靜脈將CSLNs注射到小鼠體內(nèi),考察CSLNs在活體水平上的上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像。結(jié)果表明,在980 nm激光激發(fā)下,在小鼠腫瘤處觀察到黃綠色熒光,顯示出上轉(zhuǎn)換熒光信號。解剖小鼠后,在其腫瘤、肝及肺等部位觀察到了黃綠色上轉(zhuǎn)換熒光,說明復(fù)合載體有作為生物探針的潛力。采用MTT法考察CSLNs對A549、HeLa、NCI-H460和Heβ-2細(xì)胞株的毒性,所有細(xì)胞的存活率均能達(dá)到90%以上,CSLNs的細(xì)胞毒性均較低,優(yōu)于商品試劑DOTAP和Liβofectamine2000。荷瘤小鼠經(jīng)尾靜脈注射劑量20mgkg-1的CSLNs,十天內(nèi)小鼠體重未受影響,生化指標(biāo)在正常范圍內(nèi),證明CSLNs對小鼠沒有明顯毒性。
【學(xué)位單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R450;O657.3
【部分圖文】：

基因治療??因治療（ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ）是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，通過糾正、補償基因缺陷或異常，達(dá)到治療疾病的Ｈ的。基閃治療是－？種現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，是最有希望的方法之一，一直是近年來的研究熱點。經(jīng)過近３０年的發(fā)展，ＤＮＡ重組和基

Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｈａｓｅｓ?ｆｏｒ?ｇｅｎｅ?ｔｈｅｒａｐｙ?ｉｎ?ｃｌｉｎｉｃａｌ?ｔｒｉａｌｓ??前基因治療主耍有三種方法：（１）通過導(dǎo)入正常基因到靶細(xì)胞使其對受損閃進(jìn)行修復(fù)，達(dá)到治療效果；（２）通過導(dǎo)入表達(dá)具有治療功能的蛋臼質(zhì)如子（ＴＮＦ）的基因到靶細(xì)胞，達(dá)到直接治療疾病的０的；（３）通過導(dǎo)入能致病基因合成和表達(dá)的治療基因，在靶細(xì)胞內(nèi)阻斷疾病的發(fā)生。綜上所述，優(yōu)越性在于它可以在分子水Ｔ？上修復(fù)或糾正異常基因的表達(dá)。其中在第二種代表性的是ＲＮＡＴ？擾（ＲＮＡ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，?ＲＮＡｉ）。ＲＮＡｉ是ＲＮＡ在序列錄后，基因表現(xiàn)為沉默現(xiàn)象的技術(shù)，在基閃治療研宄中越來越受到研宂者的ＲＮＡｉ的過程是內(nèi)源性或者外源性的雙鏈ＲＮＡ與細(xì)胞內(nèi)的同源序列信使Ｒｓｅｎｇｅｒ?ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）結(jié)合并使之降解，而產(chǎn)生ＲＮＡ干擾作用的基因則稱為Ａ?（ｓｍａｌｌ?ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ?ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）叫。??前，ｓｉＲＮＡ通常由２１－２３個堿基對構(gòu)成，具有極強的基因抑制能力和較好的，其基因沉默效率比傳統(tǒng)的核酶和反義核苷酸高出幾十倍甚至上千倍，極具近年來，ｓｉＲＮＡ已廣泛應(yīng)用在癌癥等重大疾病的治療中，取得了預(yù)期的治療傳統(tǒng)的治療基因方式相比，ｓｉＲＮＡ具有一定的缺陷，活體內(nèi)的核酸酶等物質(zhì)

雙功能復(fù)合載體的構(gòu)建及其基因遞送和生物成像遞送：主要是皮內(nèi)或肌肉注射、基因槍以及電穿孔；（２）化學(xué)轉(zhuǎn)染：主要使用多肽或蛋白、脂質(zhì)體、殼聚糖等基因載體進(jìn)行治療基因的遞送。??基因遞送載體??根據(jù)上文敘述，外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞并完成基因表達(dá)的過程受諸多因素影響，可因遞送載體與基因結(jié)合的方式避免基因在體內(nèi)轉(zhuǎn)運中受到降解。評價基因遞送載要標(biāo)準(zhǔn)是基因遞送效率和基因治療的安全性。其中基因遞送載體主要包括兩大類載體（ｖｉｒａｌ?ｖｅｃｔｏｒ）和非病毒載體（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ?ｖｅｃｔｏｒ）?［９１。世界范圍內(nèi)臨床基因治用的基因遞送載體如圖１．４所示。??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2864599