【摘要】：人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial virus,HRSV)是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒急性下呼吸道感染的常見病原體之一,嚴(yán)重威脅嬰幼兒的生命健康。針對(duì)HRSV流行,全球既無安全有效的疫苗應(yīng)用于臨床,也無有效的治療方法。歐美等國家目前應(yīng)用帕麗珠單克隆抗體預(yù)防早產(chǎn)兒等高危嬰幼兒的感染,但我國尚未引進(jìn)。粘附蛋白G(attachment glycoprotein,G 蛋白)和融合蛋白 F(Fusion glycoprotein,F 蛋白)是目前HRSV抗體、疫苗和其他治療方法的研制熱點(diǎn)。然而,我國與這些研究相關(guān)的HRSV病毒學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)尚不全面,制約著我國HRSV抗體和疫苗的研制。本研究通過選取我國不同代表地域HRSV標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)鑒定,闡明我國HRSV分子流行病學(xué)特點(diǎn),明確HRSV基因型分布情況、基因型更替及病毒分子進(jìn)化規(guī)律;在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步解析HRSV重要膜表面糖蛋白(G和F蛋白)的基因特征和重要抗原位點(diǎn)的變異變遷規(guī)律;為我國本土 HRSV疫苗、抗體和治療藥物的研制以及HRSV防控提供重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支持。本研究通過對(duì)2008～2015年我國東北、華北、西北、華東、華中、華南地區(qū)發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測病例的鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行HRSV實(shí)驗(yàn)室檢測,對(duì)我國發(fā)熱呼吸道癥候群中HRSV的基因特征及臨床特點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)分析。結(jié)果如下:1、2008～2015年期間共收集發(fā)熱呼吸道癥候群病例鼻咽拭子標(biāo)本4246份,HRSV核酸檢測陽性標(biāo)本705份,陽性檢出率為16.60%。2008～2015年間HRSV A、B亞型在我國不同地域均有檢出,在HRSV流行過程中呈現(xiàn)A、B亞型/基因型更替流行特點(diǎn)。在2008～2010年期間,我國HRSV以B亞型流行為主,2010～2013年則以A亞型流行為主,2013～2014年呈現(xiàn)A、B亞型共流行,在2015年再次以A亞型流行為主。提示我國HRSV在同一個(gè)流行季多以1個(gè)亞型流行為主,同時(shí)也存在A、B亞型共流行現(xiàn)象;每2～3個(gè)流行季HRSV會(huì)出現(xiàn)A、B亞型的更替。此外,我國HRSV A亞型共監(jiān)測到GA2、GA5、NA1、NA3、NA4和ON1計(jì)6個(gè)基因型,在HRSV流行過程中同時(shí)也存在著基因型更替現(xiàn)象,其中ON1基因型在2013年之后取代NA1基因型成為我國HRSV優(yōu)勢基因型。B 亞型共監(jiān)測到GB(GB2 和 GB3)、SAB4、CB1 和 BA(BA9、BA10、BAc、BA7 和BA)9個(gè)基因型,其中BA9基因型是我國B亞型的優(yōu)勢流行基因型。2、通過G蛋白編碼基因全長核苷酸序列和G蛋白羧基末端第二高變區(qū)靶基因核苷酸序列進(jìn)行比較分析,進(jìn)一步證實(shí)了 G蛋白第二高變區(qū)作為HRSV基因定型靶基因的可靠性。我國HRSV G蛋白編碼基因氨基酸變異主要發(fā)生在第二高變區(qū),且突變類型較多,存在插入,缺失以及糖基化位點(diǎn)丟失等現(xiàn)象。而在中和位點(diǎn)區(qū)和CX3C模序區(qū)(模擬CX3C分子與CX3CR結(jié)合介導(dǎo)免疫反應(yīng))氨基酸序列相對(duì)保守。3、我國HRSVF蛋白相對(duì)保守,HRSVF蛋白氨基酸同源性在99.00%以上。而結(jié)合全球20多個(gè)國家HRSV F蛋白序列,F蛋白氨基酸同源性≥98.00%。同時(shí)中國HRSV序列在抗原位點(diǎn)II區(qū)絕對(duì)保守,說明中國本土流行株對(duì)帕麗珠單克隆抗體敏感。4、分子進(jìn)化結(jié)果顯示我國HRSV G基因第二高變區(qū)的進(jìn)化速率較高。ON1基因型核苷酸進(jìn)化速率為1.80×10-3(95%HPD:1.46×10-3～2.66×10-3)堿基替代/位點(diǎn)/年。BA9基因型核苷酸進(jìn)化速率為4.38×10-3(95%HPD:2.81×10-3～6.12×10-3)堿基替代/位點(diǎn)/年。F基因進(jìn)化速率較低(0.53～0.70×10-3堿基替代/位點(diǎn)/年),種群動(dòng)態(tài)分析顯示HRSVF基因在過去的60余年相對(duì)穩(wěn)定�；谏鲜鼋Y(jié)果,本研究首次系統(tǒng)地分析了 2008～2015年我國發(fā)熱呼吸道癥候群中HRSV基因特征,初步闡明了我國HRSV亞型/基因型時(shí)空分布情況及流行傳播規(guī)律,明確了我國HRSV G、F蛋白基因特征和重要抗原位點(diǎn)的變異變遷規(guī)律,完善了我國對(duì)HRSV病毒分子進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)識(shí),建立了我國本土流行HRSV基因數(shù)據(jù)庫,為中國HRSV診斷方法的建立、種子疫苗株的篩選、預(yù)防性HRSV中和抗體的評(píng)價(jià)和治療性藥物的研發(fā)提供了重要的HRSV本土基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R56;R446.5
【圖文】：

圖３?ＲＳＶ?（Ｓｔｒａｉｎ：丨ｏｎｇ，?ＡＴＣＣ?ＶＲ－２６）?Ｆ蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＲＳＶ?Ｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｓｔｒａｉｎ：?ｌｏｎｇ，?ＡＴＣＣ－ＶＲ－２６）??ＳＰ：?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＰＥＰ２７：?Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ?２７?ａｍｉｎｏ?ａｃｉｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＦＰ：?Ｆｕｓｉｏｎ?ｐｒｏｔｅｉｎ；?ＨＲＡ：?Ｈｅｐｔａｄ?ｒｅｐｅａｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?Ａ；?ＨＲＢ：??Ｈｅｐｔａｄ?ｒｅｐｅａｔ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?Ｂ；?ＴＭ：?Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ?ｒｅｇｉｏｎ；?ＣＰ：?Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ?ｄｏｍａｉｎ??綜上，Ｇ蛋白和Ｆ蛋白是ＨＲＳＶ重要表面糖蛋白，是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的重要??抗原。Ｇ蛋白介導(dǎo)病毒對(duì)感染宿主細(xì)胞的粘附以及機(jī)體免疫反應(yīng)。Ｆ蛋白促進(jìn)相鄰細(xì)胞??的融合，導(dǎo)致局部細(xì)胞病變，在人體免疫中具有重要作用。雖然針對(duì)Ｇ蛋白的單克隆抗??體，在兩個(gè)亞型之間不能產(chǎn)生良好的交叉保護(hù)效果?＇但是針對(duì)Ｇ蛋門的某些保守區(qū)域，??通過基因突變等方法仍然能夠產(chǎn)生具有－？定交叉保護(hù)效果的抗休，并且引起較低的免疫??反應(yīng)，說明Ｇ蛋白某些片段對(duì)機(jī)休免疫系統(tǒng)的作用仍具有研究的價(jià)值４５。Ｆ蛋白具有高??度保守性，雖然針對(duì)Ｆ蛋丨的抗體能夠在Ａ、Ｂ亞型之間形成較好的交叉保護(hù)效果３８。??但是在抗原位點(diǎn)ＩＩ區(qū)某些位點(diǎn)的突變能夠?qū)е聦?duì)帕麗珠單抗的抵抗?＇?說明某些位點(diǎn)的??，且，

２、熒光定量ＰＣＲ及ＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果??根據(jù)雙通道熒光定量ＰＣＲ的方法根據(jù)ＣＴ值來進(jìn)行ＨＲＳＶ標(biāo)本及亞型的鑒定。如??圖４，藍(lán)色的為ＨＲＳＶＡ亞型陽性標(biāo)本ＣＴ值鑒定圖譜，圖中可見標(biāo)準(zhǔn)的Ｓ型曲線，ＣＴ??值為１２．００。紅色的為ＨＲＳＶＢ亞型ＣＴ值鑒定圖譜，圖中可見Ｓ曲線，ＣＴ值在１５．００??和２８．００。ＣＴ值在３５以內(nèi)且出現(xiàn)明顯的Ｓ曲線或在尾端上抬高均為陽性。??Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??２０００?－?＾?－??Ｉ?：??１５００?４－??／????？－－??，！?／?＾????＊１０００?－?■?１??－?■?？???■???—?■?■?＊?＊?－??．｜?：?ｎ?＾??５００?—?／？?／？?ｖ?－??＿Ｌ＿＿??０?１０?２０?３０?４０??Ｃｙｃｌｅｓ??圖４?ＨＲＳＶＡ?（藍(lán)色）和Ｂ?（紅色）亞型熒光定量陽性結(jié)果圖??Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｔｈｅ?ＣＴ?ｖａｌｕｅ?ｏｆ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅ?ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ?ａｓ?ＨＲＳＶ?Ａ?（Ｂｌｕｅ）?ａｎｄ?Ｂ?（Ｒｅｄ）?ｂｙ?ｒｅａｌｔｉｍｅ??ＲＴ－ＰＣＲ?ｍｅｔｈｏｄ??對(duì)ＨＲＳＶ熒光定量鑒定為陽性的標(biāo)本，進(jìn)行靶基因擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖??凝膠電泳鑒定。結(jié)果在目的條帶大小處出現(xiàn)明亮目的條帶即為擴(kuò)增成功，圖５中可見在??５００ｂｐ左右均可見到明亮目的條帶，提示靶基因擴(kuò)增成功。Ｆ基因和Ｇ基因的擴(kuò)增均可??３４??

３、病毒分離及復(fù)蘇結(jié)果??送至中國疾預(yù)防控制中心（ＣＤＣ）病毒病所麻疹室的臨床標(biāo)本均未成功病毒分離，??原始病毒株成功復(fù)蘇１０株。病變形態(tài)見圖７，普通光學(xué)顯微鏡下，與細(xì)胞對(duì)照相比，可??見細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，甚至聚集成團(tuán)。??圖７?ＨＲＳＶＨｅｐ－２細(xì)胞病變圖??Ｆｉｇｕｒｅ?７?Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ?ｅｆｆｅｃｔ?（ＣＰＥ）?ｏｆ?ＨＲＳＶ?ｏｎ?Ｈｃｐ－２?ｃｅｌｌｓ??３５??

本文編號(hào)：2855985