目的評估負性共刺激分子可溶性程序性死亡蛋白1(soluble programmed death-1,sPD-1)和可溶性程序性死亡配體1(soluble programmed death-ligand 1,sPD-L1)在肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者腹水中的表達水平,并探討其臨床意義;通過檢測HCC患者血清中的sPD-1、sPD-L1表達水平,探索其與腹水中表達水平的相關性;分析人肝癌細胞株體外培養(yǎng)液中的sPD-L1表達水平,探討sPD-L1的可能來源;為進一步研究HCC行介入途徑抗PD-L1治療提供實驗基礎和理論依據(jù)。材料與方法1.標本來源:選擇40例并發(fā)腹水的HCC患者作為實驗組,所有病例均有病理或符合臨床診斷標準確診為HCC,參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》,將實驗組分為兩個亞組:早期HCC組(臨床分期I、II期)15例、進展期HCC組(臨床分期III、IV期)25例;選取20例并發(fā)腹水的慢性乙型肝炎肝硬化患者作為對照組;體外培養(yǎng)三種人肝癌細胞株:SMMC7721、HepG2及Huh-7,獲取培養(yǎng)液,作為人肝癌細胞株組,設置不含人肝癌細胞株的空白培養(yǎng)液,作為空白對照組。2.獲取標本:分別獲取實驗組及對照組腹水和外周血血清,其中,實驗組腹水40例,外周血血清40例;對照組腹水20例,外周血血清20例。獲取上述三種人肝癌細胞株培養(yǎng)液上清液,共計3例。3.標本檢測:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測臨床標本中sPD-1、sPD-L1含量及培養(yǎng)液中sPD-L1含量。4.數(shù)據(jù)整理:觀察并記錄患者年齡、性別、肝臟手術史等一般情況;記錄留取標本當天或前后三天內的血常規(guī)、肝功能指標、腫瘤指標、血凝指標等;記錄Child-Pugh評分分級和臨床分期、BCLC分期、ECOG評分;根據(jù)實驗組患者留取標本前后一月內的增強CT或MRI,評估病灶大小、范圍、數(shù)量、門靜脈侵犯、遠處轉移等情況。5.統(tǒng)計學分析:應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x|-)±s)表示,采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗進行比較,計數(shù)資料采用率(%)表示,采用卡方檢驗進行比較。變量之間的相關性采用Pearson相關分析或Spearman相關分析;采用受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve,ROC curve)評估腹水中sPD-1、sPD-L1表達水平在診斷HCC中的敏感度及特異度。以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.臨床結果實驗組患者男性31例,女性9例,年齡為39-74(60.03±10.64)歲;臨床分期I、II期15例,III、IV期25例;BCLC分期為A期6例,B期12例,C期22例;Child-Pugh分級為A級17例,B級17例,C級6例;基線病灶直徑為(5.57±3.08)cm。對照組患者男性12例,女性8例,年齡42-82歲(61.75±12.20歲),Child-Pugh分級為A級0例,B級11例,C級9例。2.標本檢測結果2.1腹水中sPD-1、sPD-L1表達水平腹水sPD-1、sPD-L1濃度值實驗組分別為0.3895±0.1103(ng/ml)、0.7599±0.3538(ng/ml);對照組分別為0.3491±0.0786(ng/ml)、0.3521±0.2008(ng/ml)。實驗組腹水sPD-1、sPD-L1濃度值均顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。2.2血清中sPD-1、sPD-L1表達水平外周血血清中sPD-1、sPD-L1濃度值實驗組分別為0.4408±0.1158(ng/ml)、0.9067±0.23206(ng/ml);對照組分別為0.3688±0.0480(ng/ml)、0.7525±0.0888(ng/ml)。實驗組血清中sPD-1、sPD-L1濃度值顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。2.3人肝細胞肝癌細胞株體外培養(yǎng)液中sPD-L1表達水平SMMC7721、HepG2及Huh-7培養(yǎng)液中sPD-L1的濃度值分別為0.2890(ng/ml)、0.3753(ng/ml)、0.4257(ng/ml)�？瞻讓φ諛颖局衧PD-L1測得濃度值為0.1563(ng/ml)。人肝細胞肝癌細胞株體外培養(yǎng)液中sPD-L1表達水平較空白對照樣本顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。3.實驗組臨床分期亞組分析早期HCC組患者sPD-1、sPD-L1表達水平在腹水中分別為0.3367±0.0221(ng/ml)、0.5902±0.1152(ng/ml),血清中分別為0.3768±0.0549(ng/ml)、0.8023±0.2037(ng/ml);進展期HCC組sPD-1、sPD-L1表達水平在腹水中分別為0.4153±0.0884(ng/ml)、0.8362±0.4149(ng/ml),血清中分別為0.4780±0.1301(ng/ml)、0.9596±0.2261(ng/ml)。進展期HCC組患者腹水及血清中sPD-1、sPD-L1表達水平均顯著高于早期HCC組,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05)。4.HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表達水平與一般資料之間的相關性HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表達水平與BCLC分期、Child-Pugh分級、門靜脈侵犯、遠處轉移、臨床分期等指標具有不同程度的正相關(均P0.05)。與年齡、性別、外科手術史、ECOG評分、基線病灶直徑、腫瘤范圍、腫瘤直徑等指標無顯著相關性(均P0.05)。5.HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表達水平與實驗室檢驗指標之間的相關性HCC患者腹水中sPD-1表達水平與PLR、WBC、APTT、AST、ALT、AFP、PIVKA-II、PT、PT-INR水平均呈顯著正相關(均P0.05),與ALB、PAB水平呈顯著負相關(均P0.05);sPD-L1表達水平與NLR、PT-INR、PT、APTT、PIVKA-II、AST、ALT、AFP水平均呈顯著正相關(均P0.05);sPD-1、sPD-L1表達水平與LY、NE、RBC、PLT、T-BIL、AST/ALT、γ-GT、ALP、GLB、ALB/GLB、CRP、TT等指標水平無顯著相關性(均P0.05)。6.HCC患者腹水及血清中sPD-1、sPD-L1表達水平之間的相關性HCC患者腹水中sPD-1/sPD-L1表達水平同血清中sPD-1/sPD-L1表達水平具有顯著正相關(均P0.05);腹水/血清中sPD-L1表達水平同sPD-1表達水平具有顯著正相關(均P0.05)。7.受試者工作特征曲線腹水中sPD-1對應的曲線下面積為0.694(P=0.015),95%置信區(qū)間(95%confidence interval,95%CI)為(0.539-0.848),診斷HCC的最佳臨界值為0.3140(ng/ml),對應的敏感度為80.0%,特異度為55.0%。腹水中sPD-L1對應的曲線下面積為0.841(P0.001),95%CI為(0.740-0.943),診斷HCC的最佳臨界值為0.5538(ng/ml),此時的敏感度為77.5%,特異度為85.0%。結論初步研究顯示:1.sPD-1、sPD-L1在HCC患者腹水、外周血中高表達;2.sPD-L1在人肝細胞肝癌細胞株體外培養(yǎng)液中陽性表達,提示肝癌細胞可能是sPD-L1的重要來源;3.進展期HCC患者腹水及血清中sPD-1、sPD-L1表達水平顯著高于早期HCC患者;4.HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表達水平與BCLC分期、Child-Pugh分級、門靜脈侵犯等臨床指標及部分血常規(guī)炎癥指標、肝功能指標、血凝指標、腫瘤指標具有相關性,表明其在評估腫瘤侵襲性、肝功能受損、機體炎癥狀態(tài)等方面具有一定的臨床價值;5.腹水中sPD-1/sPD-L1表達水平同血清中sPD-1/sPD-L1表達水平呈正相關;腹水/血清中sPD-L1的表達水平與sPD-1表達水平呈正相關;6.腹水中sPD-1、sPD-L1檢測在HCC篩查診斷中具有潛在臨床應用價值。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7;R445.2
【部分圖文】：

負性共刺激分子 sPD-1、sPD-L1 在肝細胞肝癌患者腹水中的表達及臨床意義 材料與方法⑼顯色：加入稀釋好的底物 TMB，100μl/孔，室溫避光孵育 20min 左右；⑽終止反應：加入終止液 50μl/孔；⑾讀板：終止 10min 內，用分光光度計在波長 450nm 處讀取 OD 值；⑿計算：以標準品 sPD-1（或 sPD-L1）的濃度為橫坐標，對應的 OD450nm 值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算檢測標本中 sPD-1（或 sPD-L1）濃度。

著正相關（r=0.386,P<0.014）。（見圖 5）7.受試者工作特征曲線根據(jù)檢測數(shù)據(jù)分別繪制出腹水中 sPD-1、sPD-L1 表達水平相對應的 ROC 曲線（見圖 7）。腹水中 sPD-1 對應的曲線下面積為 0.694（P=0.015），95%置信區(qū)間（95%confidence interval,95% CI）為（0.539-0.848），約登指數(shù)最大值為 0.350，腹水中 sPD-1診斷 HCC 的最佳臨界值為 0.3140（ng/ml），對應的敏感度為 80.0%，特異度為 55.0%陽性似然比（positive likelihood ratio, +LR）為1.78，陰性似然比（negative likelihood ratio－LR）為 0.36（見表 5）。腹水中 sPD-L1 對應的曲線下面積為 0.841（P<0.001），95%CI 為（0.740-0.943），約登指數(shù)最大值為 0.625，腹水中 sPD-L1 診斷 HCC 的最佳臨界值為 0.5538（ng/ml），此時的敏感度為 77.5%，特異度為 85.0%。+LR 為 5.17，－LR 為 0.26（見表 6）。

標本中sPD-1、sPD-L1表達水平箱圖（A:腹水sPD-1；B:腹水sPD-L1；C:血清sPD-1；D:血清sPD-L1）
【參考文獻】

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本文編號：2850221