目的:土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis,FT)、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,BP)、布魯氏菌(Brucella,Bru)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis,YP)均具有高度致病性和傳染性,是重要的生物戰(zhàn)劑,對人類的健康、甚至生存,構(gòu)成極大的威脅。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確可靠及易于推廣的檢測技術(shù),以防范和應(yīng)對以上細(xì)菌可能造成的生物恐怖威脅。方法:本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amp Jlification,Real Amp),分別建立并優(yōu)化本研究中所涉及細(xì)菌的檢測體系。針對Fop A基因設(shè)計(jì)LAMP引物,檢測土拉弗朗西斯氏菌;針對Fli C基因設(shè)計(jì)LAMP引物,檢測類鼻疽伯克霍爾德菌;針對Omp25基因設(shè)計(jì)LAMP引物,檢測布魯氏菌;針對F1基因設(shè)計(jì)LAMP引物,檢測鼠疫耶爾森氏菌。以同源性較高的菌株基因組DNA作為模板,評價(jià)檢測體系的特異性;采用目標(biāo)菌的基因組DNA和質(zhì)粒作為模板,評價(jià)檢測體系的靈敏度。以質(zhì)粒菌污染環(huán)境土壤制備模擬樣本,評價(jià)檢測體系在實(shí)際環(huán)境中的檢出限和應(yīng)用價(jià)值,并與行內(nèi)認(rèn)可的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑進(jìn)行平行比對檢測實(shí)驗(yàn),評價(jià)檢測體系的準(zhǔn)確度和檢測率。結(jié)果:(1)篩選出土拉弗朗西斯氏菌FopA基因、類鼻疽伯克霍爾德菌Fli C基因、布魯氏菌Omp25基因和鼠疫耶爾森氏菌F1基因分別建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),并優(yōu)化反應(yīng)條件和體系;(2)以其他非目標(biāo)菌菌株基因組DNA和蜱蟲基因組總DNA為模板,未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增;(3)以土拉弗朗西斯氏菌基因組DNA為模板,LAMP和Real Amp技術(shù)的靈敏度分別可達(dá)4.9×10~2 cfu/m L和4.9×10~1 cfu/m L,以質(zhì)粒為模板,其靈敏度分別可達(dá)8 copies/μL和5 copies/μL;以類鼻疽伯克霍爾德菌基因組DNA為模板,LAMP和Real Amp技術(shù)的靈敏度分別可達(dá)1×103 cfu/m L和1×10~2 cfu/m L,以質(zhì)粒為模板,其靈敏度分別可達(dá)1×10~2 copies/μL和1×10~1 copies/μL;以布魯氏菌基因組DNA為模板,LAMP和Real Amp技術(shù)的靈敏度分別可達(dá)1×10~2 cfu/m L和1×10~1 cfu/m L,以質(zhì)粒為模板,其靈敏度分別可達(dá)1×10~1 copies/μL和8 copies/μL;以鼠疫耶爾森氏菌基因組DNA為模板,LAMP和Real Amp技術(shù)的靈敏度分別可達(dá)1×104 cfu/m L和1×103 cfu/m L,以質(zhì)粒為模板,其靈敏度分別可達(dá)1×10~1 copies/μL和8 copies/μL;(4)分別采用土拉弗朗西斯氏質(zhì)粒菌、類鼻疽伯克霍爾德菌質(zhì)粒菌、布魯氏質(zhì)粒菌和鼠疫耶爾森氏質(zhì)粒菌污染環(huán)境土壤建立模擬樣本,除了LAMP檢測鼠疫耶爾森氏質(zhì)粒菌的檢出限為44 cfu/g外,LAMP和Real Amp對其他質(zhì)粒菌的檢出限均可達(dá)4.4 cfu/g;且與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑平行對比檢測含高、中、低濃度(4.4×10~1 cfu/g~4.4×108 cfu/g)共24份土壤模擬樣本,結(jié)果與預(yù)期一致。結(jié)論:本研究建立的土拉弗朗西斯氏菌、類鼻疽伯克霍爾德菌、布魯氏菌和鼠疫耶爾森氏菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),特異性強(qiáng)、靈敏度高,儀器簡便、成本低廉,反應(yīng)時(shí)間較短,1 h即可完成,易于基層的推廣使用;而實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)靈敏度更,20~40min即可查看擴(kuò)增結(jié)果,簡便快速;兩種檢測技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑平行對比檢測模擬樣本,準(zhǔn)確率和檢出率均能保持持平,有望為臨床診斷、環(huán)境污染檢測、應(yīng)對生物恐怖威脅和維護(hù)公眾安全等方面提供有效、可靠的快速檢測手段。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

圖 1.2 LAMP 原理Fig 1.2 The Principle of LAMPLAMP 技術(shù)在等溫條件下高效的擴(kuò)增靶基因，水浴鍋即可滿足實(shí)驗(yàn)條避了大型循環(huán)儀的使用，成本低廉，易于基層推廣使用，無溫度變化大大反應(yīng)時(shí)間；LAMP 反應(yīng)過程中以啞鈴狀結(jié)構(gòu)作為反應(yīng)的模板，含有多個(gè)擴(kuò)位點(diǎn)，擴(kuò)增效率大大提高；LAMP 技術(shù)對目標(biāo)序列具有高度特異性，可歸LAMP 反應(yīng)的初始階段由六個(gè)獨(dú)立序列和后期由四個(gè)獨(dú)立序列識別目標(biāo)序合逆轉(zhuǎn)錄，LAMP 可實(shí)現(xiàn) RNA 序列的高效擴(kuò)增；LAMP 反應(yīng)中，產(chǎn)生大酸鎂衍生物，呈現(xiàn)白色沉淀，反應(yīng)體系渾濁，可通過肉眼判斷目的基因擴(kuò)增也可使用價(jià)格低廉的實(shí)時(shí)濁度儀提高檢測終點(diǎn)判定的準(zhǔn)確性。LAMP 技術(shù)泛應(yīng)用于對細(xì)菌、病毒、寄生蟲的快速檢測和動(dòng)物胚胎性別鑒定等領(lǐng)域[71.6 實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

3.1 電泳觀察 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)resis Observation of LAMP0 bp marker；1：陽性對照；擴(kuò)增反應(yīng)體系素優(yōu)化下易失活，因此基于 Bs于 60 ℃，Bst DNA 聚合酶影響，因此，選取 59 ℃疽菌、布氏菌、鼠疫菌分 3.2A、B、C、D。

圖 3.2 LAMP 體系溫度優(yōu)化Fig 3.2 Temperature optimization of LAMP system LAMP 擴(kuò)增溫度梯度：M：100 bp marker；1：59 ℃；2：61 ℃；3：62 ℃；；6：65 ℃；7：66 ℃；8：陰性對照；B 類鼻疽菌 LAMP 擴(kuò)增溫度梯度：M1：59 ℃；2：61 ℃；3：63 ℃；4：65 ℃；5：67 ℃；6：69 ℃；8：陰性LAMP 擴(kuò)增溫度梯度：M：100 bp marker；1：59 ℃；2：61 ℃；3：63 ℃；；6：69 ℃；7：71 ℃；8：陰性對照；D 鼠疫菌 LAMP 擴(kuò)增溫度梯度：M1：57 ℃；2：59 ℃；3：61 ℃；4：63 ℃；5：65 ℃；6：67 ℃；7：69 ℃ 體系引物對比例的單因素優(yōu)化據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 3.3A、B、C、D 可知，土拉菌、類鼻疽菌、布氏菌 1:4～1:6 時(shí)擴(kuò)增效率最高、鼠疫菌在引物對比例 1:4～1:8 時(shí)擴(kuò)增
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本文編號：2848110