目的探討益生菌改善膿毒癥小鼠生存情況及腸道微生態(tài)的可能機(jī)制。方法本研究將60只4周齡的雄性C57BL6小鼠隨機(jī)分為三組,分別為:益生菌+膿毒癥組(Probiotics+ Septic 20只),對(duì)照膿毒癥組(Control Septic 20只)和假手術(shù)組(Sham20只)。益生菌+膿毒癥組每天給予200叫益生菌(BIFICO,含長型雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌活菌數(shù)不低于1.0×107CRJ)溶液,對(duì)照膿毒癥組與假手術(shù)組每天給予200μl生理鹽水連續(xù)灌胃4周。隨后予兩組膿毒癥組小鼠盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(Cecal Ligation and Puncture CLP),空白對(duì)照組予假手術(shù)。每組10只用于觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)及7天生存數(shù)量。剩余每組10只,術(shù)后24時(shí)取血液、結(jié)腸組織、腸內(nèi)糞便;采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定每組血清中炎癥因子IL-22、IL-2、TNF-α含量;通過HE染色法觀察結(jié)腸組織形態(tài),使用抗緊密連接相關(guān)蛋白(Occludin)免疫組化觀察腸粘膜Occludin的表達(dá);隨機(jī)抽取每組5份糞便樣本,分別提取小鼠糞便DNA,通過16SrDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析腸道微生態(tài)多樣性,鑒定與比較不同處理組小鼠腸道菌群的組成及豐度差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示,采用單因素方差分析(OnewayANOVA)進(jìn)行分析,Boferroni檢驗(yàn)或Tamhane’s T2檢驗(yàn)進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正。生存分析采用log-rank檢驗(yàn)Kaplan-Meier 生存曲線。結(jié)果CLP術(shù)后第5天,Control Septic組剩余0只。Probiotics+ Septic組還剩余5只,直到術(shù)后第7天,仍有3只存活,予安樂死。Probiotics+ Septic的7天生存數(shù)量顯著高于Control Septic(P=0.042)。3種炎癥因子在Control Septic中均升高,益生菌早期干預(yù)后,IL-22、IL-2水平雖然仍高于Sham(P0.001),但較Control Septic組顯著降低(P0.001),提示益生菌有助于降低機(jī)體炎癥反應(yīng)。而TNF-α在兩組膿毒癥組血清中均高于Sham組(P0.001),提示預(yù)先給予益生菌無法降低膿毒癥小鼠TNF-α。Probiotics+ Septic組和Sham組小鼠結(jié)腸粘膜未出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)損傷,但Control Septic組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)有較大損傷。Occludin蛋白在Control Septic組小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)低于Sham組小鼠,但在Probiotics+ Septic組中Occludin蛋白的表達(dá)則高于Control Septic組小鼠。高通量測(cè)序提示Control Septic組中擬桿菌門(Bacteroide)顯著增加(P0.001),厚壁菌門(Firmicutes)顯著減少(P0.001),Probiotics+Septic組與Sham組接近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組膿毒癥組中變形菌門(Proteobactria)豐度接近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與Sham組比較,其豐度顯著增加(P0.001)。在科水平上,Control Septic 組中擬桿菌門 S24-7 科(P-Bacteroide F-S24-7)顯著增加(P0.001),厚壁菌門梭菌目(P-FirmicutesO-Clostridiales)顯著減少(Probiotics+ Septic 組 vs Control Septic 組 Pp-c=0.006;Control Septic 組 vs Sham組Pc-s=0.048),Probiotics+Septic組與Sham組在上訴兩種菌科水平豐度均接近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組膿毒癥組中變形菌門螺桿菌科(P-Proteobacteria F-Helicobacteraceae)接近,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,較 Sham 組顯著增加(Probiotics+Septic組 vs Control Septic 組 Pp-s0.001;Pc-s0.001);Probiotics+ Septic 組中變形菌門脫硫弧菌科(F-Desulfovibrionaceae)較 Control Septic 組顯著降低(P=0.021),Sham組位于兩者間,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。預(yù)先給予益生菌可穩(wěn)定膿毒癥小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu),卻無益于有害菌的減少。結(jié)論預(yù)先給予益生菌可穩(wěn)定膿毒癥小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu),減輕有害菌的毒力作用,抑制炎癥因子的釋放,從而維持腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能,減少腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白損失,抑制腸道屏障滲透,改善膿毒癥小鼠生存情況。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋?Ｓｅｐｔｉｃ組還剩余５只，直到術(shù)后第７天，仍有３只存活，予安樂死。??Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋?Ｓｅｐｔｉｃ?的?７?天生存數(shù)量顯著高于?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?組小鼠（Ｐ＝０．０４２）。１０??只Ｓｈａｍ小鼠全部存活（圖１）。??１５０１?一?Ｓｈａｍ（ｎ＝１０）??＿?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?（ｎ＝１０）??＊?？！〇〇?，??，?－１－?Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋Ｓｅｐｔｉｃ（ｎ＝?１０）??＝?—￣?十?ｒ??ｖ）?丄?ｉ??１??芒?廣－?Ｔ??ａ?５０－?１?——Ｉ??ｌ?丄??—＊?Ｊ－??０?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ??０?２?４?６?８??Ｄａｙ??圖１?ＣＬＰ術(shù)后小鼠７天生存數(shù)量。Ｓｈａｍ小鼠，ｎ＝?１０；?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ，?ｎ＝?１０；??Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ?＋?Ｓｅｐｔｉｃ，?ｎ?＝?１０（Ｐ＝０．０４２）；術(shù)后第?３?天，Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?組小鼠只剩?４?只??存活，Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋?Ｓｅｐｔｉｃ?組剩?８?只。術(shù)后第?５?天，Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ?組剩佘?０?只。Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋??Ｓｅｐｔｉｃ組還剩余５只

２．２益生菌與膿毒癥小鼠血清炎癥因子的關(guān)系??為了檢測(cè)益生菌對(duì)膿毒癥小鼠血清炎癥因子水平的影響，我們用Ｅｌｉｓａ法分別??檢測(cè)了?ＩＬ－２２、ＩＬ－２、ＴＮＦ－ａ在３組小鼠血清中的含量（表１）（圖２）。腫瘤壞死因??子ａ?（ＴＯＦ－ａ）是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與??正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。ＴＮＦ－ｃｔ在包括敗血癥的許多病理狀態(tài)下產(chǎn)生增多。??１１＾２，又名丁細(xì)胞生長因子（１＇〇６１啦〇＼＾１１￡３以〇１＇，１＇００〇，主要由活化的＃埃矗?保?福崳?胞和ＣＤ８＋Ｔ細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子。是所有Ｔ細(xì)胞亞群的生長??因子，并可促進(jìn)活化Ｂ細(xì)胞增殖，故為調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子。ＴＮＦ－ａ與ＩＬ－２??可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起腸黏膜屏障功能損傷，另外ＴＮＦ－ａ還可引起不依賴??細(xì)胞凋亡的腸黏膜屏障的通透性的增加［２４］。細(xì)胞因子ＩＬ－２２在急性炎癥期參與微生??物防御，保護(hù)和修復(fù)組織損傷，但也能夠延長宿主細(xì)菌清除時(shí)間，故其在膿毒癥??發(fā)展中有雙重免疫調(diào)節(jié)作用［３］。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，３種炎癥因子在ＣｏｎｔｒｏｌＳｅｐｔｉｃ??中均升高，益生菌早期干預(yù)后，ＩＬ－２２、ＩＬ－２水平雖然仍高于Ｓｈａｍ（Ｐ＜０．００１），但較??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ組顯著降低（Ｐ＜０．００１）

?正文結(jié)果??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ小鼠有所減輕（圖３右）。三組小鼠的結(jié)腸在上皮完整度、腺體排列??整齊度及炎性細(xì)胞浸潤程度上存在明顯差別。以上結(jié)果提示，膿毒癥嚴(yán)重破壞結(jié)??腸粘膜，而益生菌預(yù)處理能減輕膿毒癥對(duì)小腸粘膜的破壞作用。??ＷＷＶ??戀仏＇：＇??圖３益生菌預(yù)處理減輕結(jié)腸粘膜損傷。左：Ｓｈａｍ小鼠，結(jié)腸粘膜上皮完整，腺??體排列規(guī)則，少許或無炎癥細(xì)胞浸潤；中：Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｓｅｐｔｉｃ，結(jié)腸黏膜上皮腺體排列??紊亂、變形、缺失，腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)模糊，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤，可見??隱窩膿腫形成；右：Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ＋Ｓｅｐｔｉｃ結(jié)腸上皮基本完整，未見糜爛缺失，腺體排??列基本正常，炎癥細(xì)胞浸潤程較少。（上排：ＨＥ＞＜５０，下排：ＨＥｘｌＯＯ）??２．４益生菌增加膿毒癥小鼠腸粘膜緊密連接蛋白Ｏｃｃｌｕｄｉｎ的表迗??為了進(jìn)一步了解益生菌對(duì)膿毒癥小鼠腸壁屏障功能的影響
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