幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,縮寫為H.pylori或HP)是引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃MALT淋巴瘤的主要病原體,近些年,其與缺鐵性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜等胃外疾病的關(guān)系也日益受到重視。HP在全世界范圍內(nèi)有50%以上的人口感染,根據(jù)2017年最新資料,我國HP感染率約為41.7%。HP感染多發(fā)生在幼年,如不經(jīng)根除治療,機(jī)體固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答均無法將其清除。2015年在日本京都達(dá)成的“幽門螺桿菌胃炎京都全球共識”(簡稱京都共識)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了HP感染導(dǎo)致的慢性胃炎是一種感染性疾病,無癥狀感染者同樣建議根除。近些年來,由于抗生素的不合理使用,尤其是在發(fā)展中國家,細(xì)菌耐藥的現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重,而HP的根除方案往往是檢出HP感染后,給予經(jīng)驗治療方案。隨著耐藥率的上升,HP根除成功率正逐年下降。由于HP在胃內(nèi)長期定植,HP發(fā)生的基因突變和重組累積導(dǎo)致胃內(nèi)HP高度的遺傳異質(zhì)性。近年來,異質(zhì)性耐藥的現(xiàn)象得到越來越多的關(guān)注,其首次發(fā)現(xiàn)是在金黃色葡萄球菌中,而后在結(jié)核分枝桿菌、鮑曼不動桿菌及腸球菌中引起重視。異質(zhì)性耐藥對傳統(tǒng)的基于分離培養(yǎng)藥敏試驗是一個極大的挑戰(zhàn),因為臨床上對胃黏膜樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)時僅挑取有限的HP單菌落數(shù)量,有可能造成對耐藥菌落的漏選,從而導(dǎo)致根除治療失敗。對于HP異質(zhì)性耐藥的研究,已有部分報道,但僅限于對異質(zhì)性耐藥的檢測及毒力蛋白分型、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析等,并沒有對異質(zhì)性耐藥的具體特征和成因進(jìn)行進(jìn)一步分析。第一部分:對幽門螺桿菌克拉霉素、左氧氟沙星的異質(zhì)性耐藥分析及兩種檢測方法的比較本研究中,在胃鏡采樣中運用細(xì)胞刷分別刷取49例13C尿素呼氣試驗陽性患者的胃竇部和胃體部黏液組織1～2ml和糞便樣本,對胃黏液樣本進(jìn)行倍比稀釋后分離培養(yǎng),每一個樣本選取16個HP單菌落,利用鏡檢、生化實驗和質(zhì)譜方法鑒定為HP后擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行克拉霉素和左氧氟沙星Etest法藥敏試驗,分析患者胃內(nèi)的異質(zhì)性耐藥情況;同時應(yīng)用數(shù)字微滴PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法對胃黏液樣本和糞便樣本同時進(jìn)行HP 16S rRNA和23S rRNA野生型和突變型的檢測,以期建立一種基于糞便的對HP感染及部分抗生素耐藥性的無創(chuàng)檢測方法。研究結(jié)果表明:用分離培養(yǎng)、胃黏液ddPCR和糞便ddPCR的方法,49例患者中分別得到43例、46例、43例HP陽性。對所得HP克隆進(jìn)行克拉霉素Etest藥敏試驗后發(fā)現(xiàn),23個樣本中所有HP克隆為克拉霉素敏感克隆、11個樣本為異質(zhì)性耐藥、9個樣本中所有HP克隆為克拉霉素耐藥克隆。對來自15個胃竇黏液樣本的160個HP克隆進(jìn)行左氧氟沙星Etest藥敏試驗發(fā)現(xiàn),其中有8個樣本中所有HP克隆為左氧氟沙星敏感克隆、3個異質(zhì)性耐藥樣本和4個樣本中所有HP克隆為左氧氟沙星耐藥克隆。利用ddPCR的方法對胃黏液和糞便樣本中克拉霉素耐藥基因HP 23S rRNA基因型進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),胃黏液樣本中22例野生型、13例為野生型與突變型的混合、10例突變型,胃竇樣本與胃體樣本一致;糞便樣本中17例野生型、17例為野生型與突變型的混合、11例突變型;比較胃黏液樣本與糞便樣本發(fā)現(xiàn)其中33例(75%)表現(xiàn)一致:15例野生型、10例混合型、8例突變型。比較克拉霉素Etest試驗與HP 23S rRNA ddPCR檢測后:發(fā)現(xiàn)43例中有37例(86%)結(jié)果一致:19例敏感/野生型、9例異質(zhì)性耐藥/混合型、9例耐藥/突變型。本研究首次利用無創(chuàng)細(xì)胞刷刷取胃黏液進(jìn)行HP分離培養(yǎng),并首次對比了數(shù)字PCR(ddPCR)方法和傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對于HP感染和克拉霉素耐藥檢測(尤其是異質(zhì)性耐藥檢測)的效果,發(fā)現(xiàn)患者感染的HP對克拉霉素和左氧氟沙星存在明顯的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象,且ddPCR方法檢測克拉霉素耐藥靈敏度更高;發(fā)現(xiàn)于糞便樣本的ddPCR方法對HP感染和克拉霉素耐藥的檢出與基于胃黏液ddPCR和基于分離培養(yǎng)的Etest方法同樣有效,有望成為一種無創(chuàng)的檢測克拉霉素耐藥的新方法。第二部分:幽門螺桿菌對克拉霉素異質(zhì)性耐藥樣本相關(guān)菌株的MLST分析本研究利用多位點序列分析技術(shù)(multilocus sequence typing,MLST)結(jié)合HP克隆對克拉霉素耐藥情況對來自6個克拉霉素異質(zhì)性耐藥樣本的81個HP克隆進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。研究結(jié)果顯示:6個樣本的最低抑菌濃度值差異較大,最大值與最小值的差別在2～3個數(shù)量級之間。MLST分析中81個HP克隆總共得到17個ST型別,均為新的ST型,每個樣本的9～16個克隆可分為1～6個ST型,結(jié)合vacA基因差異,進(jìn)一步分為2～8個基因型。在遺傳進(jìn)化樹中,每個樣本的HP克隆分別聚為一簇,來自同一樣本的HP克隆遺傳距離遠(yuǎn)小于樣本間HP克隆群的遺傳距離。異質(zhì)性耐藥樣本中近源HP克隆可表現(xiàn)為對克拉霉素一致的敏感性,也可表現(xiàn)出對克拉霉素敏感性的較大差異;反映耐藥壓力篩選和細(xì)菌耐藥負(fù)擔(dān)在不同患者胃內(nèi)HP的菌株演化中的作用不同。
【學(xué)位單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5;R573
【部分圖文】：

３７．２７％。對于克拉霉素中介耐藥的ＨＰ克隆，此次我們在２３個樣本中發(fā)現(xiàn)了中??介耐藥的ＨＰ克隆，其中１４個為敏感樣本，９個異質(zhì)性耐藥樣本。將所有納入克??拉霉素Ｅｔｅｓｔ的ＨＰ克隆的ＭＩＣ值進(jìn)行整理后作散點圖，如圖１。??■?Ｉｓｏｌａｔｅ?Ｎｕｍｂｅｒ??１２８?－?？?１?？?８?０?１６?．??９６?－?？??６４?－?？?？?＃?？?？魯??４８?－?？?？??３２?－?？？??２４?－?？？參?？?？??１６?－?？？?？?？？??１２?－?？?？?？?？?＃?？??８?－?？?＃?？??３?６?－?？??４?－??Ｃ?３?？??Ｓ?２?－??１５－?？??ｙ?ｉ－?？？?？?？??２！?〇?７５?－??０?５?－??０?３８?－??０?２５?－?？？？？?．？？？？＜？？？?％?？？??０?１９－?？？？＃?？?？?？?？?？?？?？?？籲?？??０．１２５?－?？?？？參？？？？？＊＃＃?？??０．０９４?－?？＃＃？？？?？?？?？?？?？??０．０６４?－?？?？?？?？??０．０４７?－?？?＃?參？?？??０?０３２?－?？?？??０．０２３?－??０．０１６?－?？?？??、麟徽傷纖鱗鱗纖纖纖鱗纖総纖鱗子??Ｓａｍｐｌｅ?Ｎｏ．??圖１分離培養(yǎng)陽性樣本中ＨＰ克隆克拉霉素ＭＩＣ值的分布。圖中ｘ軸代表樣本編??號

ｍｇ／Ｌ的克隆，判定為左氧氟沙星耐藥克隆，ＭＩＣ值小于ｌｍｇ／Ｌ的克隆判定為敏??感克隆。本次試驗中，共有１２３個左氧氟沙星敏感ＨＰ克隆和３７個耐藥克隆。??將所有納入左氧氟沙星Ｅｔｅｓｔ的ＨＰ克隆的ＭＩＣ值進(jìn)行整理后作散點圖，圖２。??對來源于１５個樣本的ＨＰ克隆進(jìn)行左氧氟沙星Ｅｔｅｓｔ藥敏檢測后發(fā)現(xiàn)，有８??個樣本其分離培養(yǎng)所得所有克隆均表現(xiàn)為左氧氟沙星敏感克隆，３個樣本所有克??隆均為左氧氟沙星耐藥克隆，４個克隆表現(xiàn)為異質(zhì)性耐藥，即同時含有左氧氟沙??星耐藥克隆和敏感克隆。異質(zhì)性耐藥樣本中，耐藥克隆在樣本分離所得克隆個數(shù)??中所占比例為１１．１１％、１５．３８％和２０．００％。??異質(zhì)性耐藥樣本間ＭＩＣ值范圍差異較大，同一樣本內(nèi)ＭＩＣ最大值和最小值??的比值可達(dá)８６０倍，３個異質(zhì)性耐藥樣本中，該比值在８５？８６０之間，平均值??為２９７。不僅僅是異質(zhì)性耐藥樣本，在全敏感樣本和全耐藥樣本中，部分樣本也??存在樣本內(nèi)部ＭＩＣ值差異較大的現(xiàn)象

Ａ２１４２Ｇ，?Ａ２１４２Ｃ三種突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變型２３Ｓ?ｒＲＮＡ在混合ＤＮＡ中占??０％，１％，１０％，５０％，９９％和１００％的情況下，ｄｄＰＣＲ的方法可以檢出＞９５％的突??變型或野生型２３Ｓ?ｒＲＮＡ基因，圖３。在樣本中僅含有２３Ｓ?ｒＲＮＡ的野生型或突??變型時，不會檢測到另一種基因型。ｄｄＰＣＲ方法檢出的２３ＳｒＲＮＡ的野生型或突??變型在總２３?ｒＲＮＡ所占比例與原始樣本中的比例無明顯差異。??１２０??Ｃ／）??三＝１００?ＷＴＡ?丁工?＿Ａ２１４３Ｇ??豈ｆ?＾?切?ＤＡ２１４２Ｇ??｜ｃ?告?８０?ｆ?＾?Ｔ?０Ａ２１４２Ｃ??０３?ｔ〇?＾?＞?Ｉ??ＩＨ－彡?｜??＜．ｅ?＾?＾?ｙ?＾??ｌ｜ｉ?４〇?＾?Ｊ?ｉｐ
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本文編號：2838482