【摘要】：鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)已成為引起醫(yī)療相關(guān)性腦膜炎的重要革蘭陰性菌,特別是在神經(jīng)外科的手術(shù)病人中。碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的出現(xiàn)并在世界范圍內(nèi)快速播散及廣泛流行,使得鮑曼不動桿菌腦膜炎治療中可供選擇的抗生素十分有限,同時許多藥物難以透過血腦屏障,因此鮑曼不動桿菌腦膜炎的治療成為臨床面臨的巨大難題。盡管目前已有大量鮑曼不動桿菌相關(guān)的分子流行病學(xué)調(diào)查,但菌株來源往往以呼吸道和血流為主,腦脊液分離菌株的分子流行病學(xué)特征研究仍然缺乏。腦脊液來源菌株和其他來源菌株之間的比較研究則更為少見。因此我們開展了本研究,在為鮑曼不動桿菌腦膜炎的臨床治療和防控提供有力依據(jù)的同時,探索不同分離來源菌株間是否存在遺傳背景的差異,以便更加精準地治療鮑曼不動桿菌引起的各種不同類型的感染。鮑曼不動桿菌在導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時受到獨特的腦脊液環(huán)境壓力,其在腦脊液中的生長適應(yīng)機制為鮑曼不動桿菌引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的致病機制提供了線索,也為疾病的治療提供了潛在靶點。本研究的第一章,通過收集上海及浙江多家醫(yī)院在2013年4月-2016年11月間腦脊液來源的鮑曼不動桿菌菌株54株,以及同期分離的血流來源菌株21株,對其進行藥物敏感性試驗,脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE),全基因組測序,MLST和cgMLST分型以及泛基因組關(guān)聯(lián)分析研究。研究結(jié)果顯示腦脊液分離得到的鮑曼不動桿菌中94.4%是CRAB菌株,并且對美羅培南的MIC值均在32μg/mL以上。同時這些菌株對除外替加環(huán)素和多粘菌素的其他種類抗生素的耐藥率也均在90%以上,有1/6左右的腦脊液分離株對替加環(huán)素不敏感。所有菌株目前對多粘菌素仍保持100%的敏感率。21株血流分離株在耐藥表型上和腦脊液分離株無明顯差異。納入研究的所有54株腦脊液分離株可分為10個已知的ST型以及4個新ST型。ST195是最常見的ST型,占了腦脊液分離株菌株的35.2%(n=19)。ST195菌株在血流來源菌株中也占首位,其次為ST208。54株腦脊液分離鮑曼不動桿菌中有50株細菌屬于國內(nèi)流行的CC92克隆復(fù)合體。3株非CC92克隆復(fù)合體的菌株分離自神經(jīng)外科病人,提示神經(jīng)外科分離的鮑曼不動桿菌遺傳背景更具多樣性。blaOXA-23基因是腦脊液分離菌株中唯一檢測到的獲得性碳青霉烯酶耐藥基因。除了鮑曼不動桿菌中常見的β內(nèi)酰胺酶(ADC,TEM-1D等)外,還檢測到3株腦脊液分離株攜帶編碼CTX-M-55型的β-內(nèi)酰胺酶基因,其中的2株還共同攜帶有磷霉素耐藥基因fosA。PFGE的結(jié)果顯示屬于CC92克隆復(fù)合體的菌株具有高度的同源性。通過cgMLST分型,可觀察到在研究期間多克隆來源的菌株在院內(nèi)播散流行,導(dǎo)致鮑曼不動桿菌腦膜炎的發(fā)生。某些不同醫(yī)院內(nèi)腦脊液分離得到的鮑曼不動桿菌菌株間也具有高度相似的遺傳背景,提示了鮑曼不動桿菌存在院際之間克隆傳播的可能。腦脊液分離株和血流分離株之間遺傳背景也高度相似,血流分離菌株在耐藥表型、耐藥基因分布、ST分型、PFGE聚類分析以及cgMLST分型及泛基因組關(guān)聯(lián)分析中均未顯示出和腦脊液來源的菌株有明顯差異。另外我們還證實了 cgMLST分型較傳統(tǒng)的PFGE和MLST分型方法具有更高的分辨率和準確性。本研究的第二章,從上一部分研究的腦脊液分離菌株中選擇了一株最常見的ST195型菌株C25,在體外進行了該菌株人腦脊液中生長的全局轉(zhuǎn)錄組研究。研究顯示,在腦脊液中生長時C25菌株中有1551個基因較其在LB肉湯培養(yǎng)基中生長時發(fā)生了差異表達(log2 | Fold change | ≥1,false discovery rate,FDR p≤0.001),大約占了 C25全基因組基因的2/5。其中有794個基因表達下調(diào),757個基因表達上調(diào)。通過直系同源群COG富集分析顯示發(fā)生表達下調(diào)的基因主要富集在COG分類中J類(翻譯和核糖體功能)和U類(細胞內(nèi)運輸、分泌和囊泡運輸)中。而表達上調(diào)的基因僅在S(未知功能類)和K(轉(zhuǎn)錄)兩個分類中發(fā)生了富集。以上結(jié)果顯示了在體外腦脊液環(huán)境中鮑曼不動桿菌C25的低生長和生物合成狀態(tài)。一些已知的鮑曼不動桿菌毒力因子在腦脊液組中也發(fā)生差異表達。其中鐵攝取相關(guān)基因,包括兩組嗜鐵素基因簇和血紅素利用相關(guān)的基因簇表達上調(diào);和生物被膜形成相關(guān)的AdeFGH外排泵和群體感應(yīng)系統(tǒng)的abaI基因表達也有上調(diào)。針對鐵合成和生物被膜形成相關(guān)通路可能可以作為鮑曼不動桿菌腦膜炎治療的潛在靶點。而表達明顯下調(diào)的基因主要集中在一些膜孔蛋白基因(ompA,ompW和carO)和部分脂多糖合成的基因以及莢膜生物合成基因中。以上變化反應(yīng)了鮑曼不動桿菌在腦脊液乏鐵環(huán)境下的獨特適應(yīng)性變化。莢膜,脂多糖以及外膜蛋白等細胞表面毒力因子的表達下調(diào)也反應(yīng)了細菌在腦脊液環(huán)境中細胞膜生物合成受限。體外腦脊液環(huán)境并不利于鮑曼不動桿菌的生長。綜上所述,本研究明確了華東地區(qū)5家醫(yī)院腦脊液分離鮑曼不動桿菌的分子流行病特征,并利用cgMLST分型的方法明確了鮑曼不動桿菌在導(dǎo)致醫(yī)療相關(guān)性腦膜炎發(fā)生時多克隆來源菌株的院內(nèi)感染傳播模式。腦脊液分離菌株和同期血流感染分離菌株在遺傳背景上無顯著差異。同時我們首次進行了鮑曼不動桿菌臨床菌株在體外人腦脊液中生長的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,得到了其在體外人腦脊液中生長的全局轉(zhuǎn)錄組學(xué)特點和已知毒力因子基因的差異表達變化規(guī)律。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R742.9;R446.14
【圖文】：

曼不動桿菌中５１株對美羅培南耐藥，同時這５１株ＣＲＡＢ菌株對哌拉西林／他唑逡逑巴坦、頭孢哌酮／舒巴坦、左氧氟沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟、四環(huán)素、慶大霉逡逑素的耐藥率均在９０％以上（圖１．邋１）。另外有１株腦脊液分離菌株對替加環(huán)素耐藥逡逑（ＭＩＣ邋＝邋４ｎｇ／ｍＬ），９株為替加環(huán)素中介菌株，其余４４株對替加環(huán)素敏。所有腦逡逑脊液分離株對多粘菌素的敏感率為１００％。而同期血流分離菌株的抗生素敏感性試逡逑驗和腦脊液組細菌相近（附表１．３）。逡逑值得注意的是，所有ＣＲＡＢ菌株的美羅培南ＭＩＣ值均在３２邋ｐｇ／ｍＬ以上，且逡逑超過三分之一的菌株的美羅培南ＭＩＣ值大于等于１２８邋ｐｇ／ｍＬ。另有３株腦脊液分逡逑離株和１株血液分離株對美羅培南敏感，它們對其他類別抗生素均保持良好的敏逡逑＿敏感■中介■耐藥逡逑替加環(huán)索逡逑ＲＸ９９邐４６邐＿逡逑四環(huán)索Ｂｆｃｉ邐４９逡逑頭孢毗肟Ｄｈ邐５０邐｜逡逑頭ｍ他啶５0邐0逡逑左氧ｍ沙ｓ邋Ｅｌ逡逑關(guān)羅培南Ｄ邐５１邐0逡逑頭孢哌酮／舒巴坦４９邐｜逡逑懪拉西林／他畦巴坦０邐５１邐０逡逑圖１．１腦脊液分離鮑曼不動桿菌菌株藥敏結(jié)果逡逑感性。逡逑１３逡逑

（ｈｔｔｐ：／／ｅｂｕｒｓｔ．ｍｌｓｔ．ｎｅｔ／）按照默認參數(shù)選項（７個管家基因中有６個一致并且菌株逡逑數(shù)目大于３為定義為一個克隆復(fù)合體ｃｌｏｎａｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，邋ＣＣ）邋，邋５０個腦脊液分離菌逡逑株被劃為一個克隆復(fù)合體（圖１．２），其中２株是目前尚未定義的新ＳＴ型，均為逡逑ＳＴ５４０的單位點變異型（Ｓｉｎｇｌｅ邋ｌｏｃｕｓ邋ｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＶ），在本研究中將其命名為ＮＴ５４０．１逡逑１４逡逑

所有７５株細菌拼接完成的基因俎草圖上傳至ＣＧＥ網(wǎng)站（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ逡逑／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＲｅｓＦｉｎｄｅｒ－２．１／）利用ＲｅｓＦｉｎｅｒ數(shù)據(jù)庫工具比對，菌株獲得性耐藥基因的分逡逑布可見圖１．３。鮑曼不動桿菌產(chǎn)生碳青霉烯類抗生素耐藥性的主要機制包括產(chǎn)碳青逡逑霉烯酶、膜孔蛋白突變、外排泵高表達等，其中以產(chǎn)Ｄ類碳青霉烯酶苯唑西林酶逡逑（ＯＸＡ型碳青霉烯酶）這一機制最為重要�；蚴悄X脊液分離株中所有逡逑ＣＲＡＢ菌株中唯一被檢測到的獲得性碳青霉烯酶耐藥基因。其他常見的獲得性逡逑ＯＸＡ型碳青霉博酶耐藥基因如以及金屬酶基逡逑因均未被檢測到。在所有腦脊液分離株中均檢測到定位于鮑曼不動桿菌染色體上逡逑的基因，其中以基因占絕大多數(shù)，和之前的文獻報道一致，編逡逑碼ＯＸＡ－６６型破青霉q婷傅木昃粲諗分蘅寺∑紫擔桑懾澹ǎ牛酰潁錚穡澹幔鑠澹悖歟錚睿幔戾澹歟椋睿澹幔紓澹簀義希桑桑�，也就是用劗峨sΦ模茫茫梗部寺「春咸澹郟玻梗蕁＃粗攴牽茫茫梗部寺「春咸宓哪約掛哄義戲擲脛曇觳獾攪隋澹粗植煌模祝媯歟錚恚緇潁直鴇嗦耄希兀粒叮�，ＯＸＡ－６ＡP希兀粒叮�，辶x希希兀粒保玻靶吞記嗝瓜┟�。同时所有募s掛壕曛芯觳獾皆誆歡司糝兇畛＜義系謀嗦臚鋒呔孛傅幕潁簦常ǎ傘＃祝幔睿幕蛟冢常噸昴約掛悍擲脛曛斜誨義霞觳獾�。译E狹街鄭校邗０訪富虻母弒韽趾捅歡司氖姘吞鼓鴕┗潑芮繡義希保靛義

本文編號：2801411