【摘要】：蛋白聚糖(Proteoglycan,PG)是生物體內(nèi)的一類復(fù)雜的生物大分子,由一個(gè)核心蛋白和共價(jià)偶聯(lián)的一條或者幾條糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)側(cè)鏈構(gòu)成。GAGs又名粘多糖,是一種聚陰離子直鏈雜多糖,由重復(fù)的二糖單位連接而成。根據(jù)單糖殘基種類、殘基間糖苷鍵的類型以及糖鏈上硫酸基的數(shù)目和位置不同,可以分為透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)、硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)/硫酸皮膚素(Dermatan sulfate,DS)、硫酸角質(zhì)素(Keratan sulfate,KS)和肝素(Heparin,Hep)/硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)四大類,其中HA是唯一一種不能與核心蛋白結(jié)合形成PGs的GAGs。PGs廣泛存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中,它們可以和生長因子、細(xì)胞因子等生物分子相互作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化和細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理病理過程,在醫(yī)學(xué)藥學(xué)等領(lǐng)域具有廣范的研究和應(yīng)用價(jià)值�；赑Gs核心蛋白種類的多樣性,及GAGs側(cè)鏈的種類和數(shù)目多樣性使得PGs結(jié)構(gòu)和種類復(fù)雜多樣,其中GAGs側(cè)鏈的復(fù)雜性為PGs功能的多樣化提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在GAGs側(cè)鏈合成過程中多種酶對其進(jìn)行了特異性修飾,使得糖鏈結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜多樣,這種結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性賦予了它們功能上的多樣性,但也給其檢測帶來了巨大的困難。目前常用的GAGs/PGs檢測方法有基于堿性染料的GAGs化學(xué)染色法、基于核心蛋白特異性抗體和GAGs側(cè)鏈的專一性降解酶的生化檢測,以及利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)和核磁共振波譜法(Nuclear magnetic resonance,NMR)的儀器分析法等。但是這些檢測方法還存在著很多不足,如生物相容性差,不適合活體染色;檢測靈敏度低,選擇性差;實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,檢測時(shí)間長;實(shí)驗(yàn)所需儀器和維護(hù)費(fèi)用昂貴等。因此,目前急需開發(fā)一種簡便、高效、靈敏且生物相容性好的GAGs/PGs檢測方法。高正電荷綠色熒光蛋白(Supercharged green fluorescent protein,ScGFP)是一種通過基因工程改造手段獲得的帶有36個(gè)正電荷的綠色熒光蛋白,它的細(xì)胞毒性低,生物相容性好,熒光穩(wěn)定性高,且細(xì)胞穿透能力強(qiáng),在生物大分子分析檢測和跨膜運(yùn)輸中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本論文以ScGFP為生物探針,結(jié)合GAGs特異性降解酶和針對于PGs核心蛋白的特異性抗體,針對GAGs和PGs檢測中急需解決的問題,在分子、細(xì)胞和器官水平上首次將ScGFP運(yùn)用于GAGs/PGs的分析檢測,并在對相關(guān)分析條件進(jìn)行了全面優(yōu)化的基礎(chǔ)上,將其應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本和臨床樣品的檢測。檢測結(jié)果證明了 ScGFP作為一種新型的生物相容性熒光探針,在GAGs/PGs的分析檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本論文的主要研究成果如下所述:1.以石墨烯和ScGFP為探針的GAGs均相檢測方法的建立與應(yīng)用:在均相檢測體系中利用氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作為熒光淬滅劑,通過能量共振轉(zhuǎn)移可以對ScGFP進(jìn)行熒光淬滅,但是這種淬滅作用在溶液中存在GAGs時(shí)會被抑制。GAGs與ScGFP通過電荷相互作用而結(jié)合,進(jìn)而阻礙GO的淬滅作用,與沒有加入GAGs的陰性對照相比出現(xiàn)熒光恢復(fù)現(xiàn)象,且具有劑量依賴關(guān)系,因此可以根據(jù)溶液中熒光恢復(fù)的強(qiáng)度來對均相檢測體系中GAGs進(jìn)行定量分析。均相檢測方法建立后,首先對各個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,通過優(yōu)化最終獲得了最佳反應(yīng)緩沖液為l10mM Tris-HCl,100 mM NaCl,pH 7.4;最佳反應(yīng)順序?yàn)橄然旌蟂cGFP與GAG再加入GO;ScGFP和GO的最佳反應(yīng)終濃度分別為2.5μg/ml和50 μg/ml,以及最佳反應(yīng)時(shí)間為室溫避光反應(yīng)30 min。在最佳反應(yīng)條件下對緩沖溶液中不同種類、不同濃度的GAGs進(jìn)行檢測。不同種類的GAGs與ScGFP的結(jié)合能力不同,因而介導(dǎo)的熒光恢復(fù)能力也不同。Hep與ScGFP的結(jié)合能力最強(qiáng),結(jié)合常數(shù)為9.35E7/摩爾,介導(dǎo)熒光恢復(fù)的能力最強(qiáng),檢測得到的熒光讀數(shù)最高;CSA和DS與ScGFP的結(jié)合能力次之,結(jié)合常數(shù)值分別為4.53E7/摩爾,4.54E7,檢測得到的熒光讀數(shù)次之;HA與ScGFP的結(jié)合能力最弱,檢測到的熒光讀數(shù)太弱以致不能計(jì)算出相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)。在不同濃度GAGs的檢測中還發(fā)現(xiàn)隨著檢測體系中GAGs濃度的升高,檢測到的熒光數(shù)值逐漸增強(qiáng),兩者之間存在著很好的線性關(guān)系。通過制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以對溶液中的GAGs含量進(jìn)行快速檢測。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于血清中Hep的檢測,檢測結(jié)果表明這種均相檢測方法對于復(fù)雜生物樣品中GAGs的檢測依然有效,是一種簡單可靠的血清Hep檢測方法,這在臨床中監(jiān)測血液中Hep的給藥濃度,減少因Hep過量使用引起的出血等并發(fā)癥具有重要的意義。最后利用該均相檢測方法對Hep中其它GAGs雜質(zhì)和過硫酸化硫酸軟骨素(Oversulfated chondroitin sulfate,OSCS)污染物進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明該檢測方法對于Hep中其它GAGs雜質(zhì)的檢測不靈敏,但可以最低檢測到10-6(w/w)%的OSCS。因此對于Hep中痕量OSCS污染物的檢測具有著較高的特異性和靈敏度,為Hep藥品質(zhì)量的監(jiān)測提供了一種有效方法。該新型均相檢測方法與傳統(tǒng)方法相比,具有簡單、快速和靈敏的特點(diǎn),在GAGs樣品的分析檢測和質(zhì)量控制中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.ScGFP對活細(xì)胞表面和小鼠器官中GAGs的可視化檢測:根據(jù)ScGFP生物相容性好,細(xì)胞毒性低,穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),將其作為熒光探針對活細(xì)胞表面以及小鼠活體內(nèi)臟器官中GAGs的種類和含量進(jìn)行了可視化檢測。結(jié)果表明不同種類細(xì)胞表面的GAGs種類和含量各不相同,其中A549細(xì)胞表面的CS/DS含量高于Hep/HS含量,而HEK 293T細(xì)胞表面的Hep/HS含量則高于CS/DS含量,這些結(jié)果與各細(xì)胞的GAGs提取分析結(jié)果相一致。此外將ScGFP通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),觀察小鼠器官中GAGs的分布。通過可視化檢測發(fā)現(xiàn)ScGFP可以較長時(shí)間的結(jié)合在小鼠各器官中,在小鼠體內(nèi)的降解代謝較為緩慢,8小時(shí)時(shí)檢測到的熒光強(qiáng)度依舊很高。通過不同種類GAGs特異性降解酶的輔助檢測發(fā)現(xiàn)用GAGs降解酶處理過的小鼠內(nèi)臟器官熒光強(qiáng)度顯著減弱,且硫酸軟骨素ABC酶處理后的小鼠器官熒光強(qiáng)度比肝素酶降解處理后的熒光強(qiáng)度弱,這表明小鼠各器官中ScGFP的停留是由于它與GAGs相互作用的結(jié)果,且小鼠各器官的CS/DS表達(dá)含量多于Hep/HS表達(dá)含量。通過ScGFP熒光探針的使用,我們可以簡便高效的對活細(xì)胞及器官中的GAGs進(jìn)行可視化檢測,檢測結(jié)果清晰可見。這表明ScGFP是一種有效的GAGs可視化檢測探針,首次為眾多生理病理過程中GAGs可視化與檢測提供了穩(wěn)定可靠的高生物相容性熒光探針,具有著重要的意義。3.PGs均相檢測方法的建立和在HCC體外診斷中的應(yīng)用:通過抗原制備,小鼠免疫,細(xì)胞融合,雜交瘤篩選,抗體純化等過程獲得了兩種針對于蛋白聚糖Glypican-3(GPC3)核心蛋白不同抗原表位的高親和力單克隆抗體。利用抗原抗體的特異性結(jié)合以及電荷間的相互作用建立了一種簡便、靈敏、高效的GPC3均相檢測方法。其檢測原理為:偶聯(lián)于羧基石墨烯表面的兩種不同的單克隆抗體可以識別GPC3核心蛋白的不同抗原表位,在反應(yīng)體系中通過共同結(jié)合GPC3而形成夾心結(jié)構(gòu);GPC3又可以通過HS側(cè)鏈結(jié)合ScGFP,使其位于夾心結(jié)構(gòu)的中間,同時(shí)拉近其與石墨烯的距離,導(dǎo)致更大程度的熒光淬滅,最終通過熒光淬滅程度來檢測體系中GPC3的含量。該均相檢測方法建立后首先對其各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,通過優(yōu)化得到試劑的最佳添加順序?yàn)橄燃尤虢Y(jié)合有一種抗體的石墨烯與GPC3,再加入ScGFP,最后加入結(jié)合有另一種抗體的石墨烯,這種添加順序可以使ScGFP位于夾心結(jié)構(gòu)中間,其熒光可以得到最大程度的淬滅,以此來提高檢測的靈敏度。除此之外,其它的優(yōu)化條件分別為:選用羧基石墨烯作為熒光淬滅試劑,并在羧基石墨烯上偶聯(lián)終濃度為0.01 mg/ml的單克隆抗體,隨后石墨烯上其他部位用1%的BSA進(jìn)行封閉;在110mM Tris-HCl,100 mM NaCl,pH 10.0緩沖體系中加入抗體1-石墨烯和GPC3室溫避光放置5 min,隨后加入終濃度為0.375 μg/ml的ScGFP,室溫避光放置15 min,最后加入抗體2-石墨烯室溫避光孵育110min,并檢測熒光強(qiáng)度。利用這種新型均相檢測方法對緩沖溶液和血清中的GPC3進(jìn)行定量分析,結(jié)果表明ScGFP的熒光淬滅程度隨著檢測體系中GPC3含量的增加而增強(qiáng),ScGFP的熒光淬滅程度與GPC3含量的log2數(shù)值存在著較好的線性關(guān)系,因此可以通過制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,對未知濃度的GPC3樣品進(jìn)行定量檢測。最后,將該方法成功應(yīng)用于臨床HCC血清樣本GPC3的檢測,結(jié)果表明HCC組的GPC3含量平均值顯著高于正常組和良性肝病病人組的平均值,HCC組的GPC3平均含量是正常組含量的12倍,是良性肝病病人組的8倍。以良性肝病病人組GPC3含量的平均值加兩倍的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值3.71 ng/ml來作為HCC的檢測下限值,其檢測靈敏度為59.5%,高于其它檢測方法56%(53-59%)的靈敏度。該新型均相方法與傳統(tǒng)的夾心ELISA法相比,操作簡單,無需反復(fù)的孵育洗雜過程,檢測靈敏度高,特異性好,同時(shí)檢測迅速,檢測反應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)可以完成,在HCC的早期診斷中具有著重要的應(yīng)用價(jià)值。此外這種均相檢測方法也為各種其它PGs的分析檢測建立了通用的技術(shù)平臺。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;R446.1
【圖文】：

１．２糖胺聚糖（ＧＡＧｓ）的結(jié)構(gòu)功能及檢測逡逑１．２．１邋ＧＡＧｓ的結(jié)構(gòu)和分類逡逑ＧＡＧｓ主要分為四大類：ＨＡ、ＣＳ／ＤＳ、ＫＳ和Ｈｅｐ／ＨＳ，其二糖結(jié)構(gòu)如圖１－逡逑１所示。逡逑Ｌ邐Ｊｎ邋Ｌ邐ＯＨ邋ＨＯ’邋ＮＨＡｃ邋ｎ逡逑Ｄ－ＧｌｃＵＡ邐Ｄ￣＜；ｌｃＮＡｃ邐Ｄ＿Ｇａｉ邐Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ逡逑ＨＡ邐ＫＳ逡逑Ｄ－Ｃ１ＣＵＡ邐Ｄ＾１ＮＡＣ邐Ｌ－ｌｄｏｌＡ邐ＤＣａｌ．ＮＡｃ逡逑ｃｓ邐ＤＳ逡逑Ｄ－ＣｌｃｌＡ邋Ｉ＞－Ｇ１ｃＮ０３Ｈ／Ｄ－Ｇ１ｃＳＡｃ邐Ｌ－ＩｄｏＵＡ邋Ｄ－ＧｌｃＮＳＯ，Ｈ／Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ逡逑ＨＳ邐Ｈｅｐ逡逑Ｒ：Ｈ／Ｓ０３－，邋Ｒ，邋：Ｓ０，－／Ａｃ逡逑圖１－１糖胺聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)逡逑１４逡逑

在本章節(jié)中我們將以ＳｃＧＦＰ為生物探針，探究一種簡便、高效、靈敏的ＧＡＧｓ均逡逑相檢測方法。逡逑新型均相檢測方法的檢測原理如圖２－１所示。圖（ａ）中的氧化石墨烯逡逑（Ｇｒａｐｈｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ，ＧＯ邋）是一種焚光洋滅試劑，可以通過能量共振轉(zhuǎn)移逡逑（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）作用將焚光蛋白的焚光進(jìn)行淬滅逡逑（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２０１１，邋Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．２０１０，Ｗａｎｇｅｔａｌ．２０１０）。但當(dāng)溶液中存在邋ＧＡＧｓ逡逑時(shí)（如圖ｂ所示），由于電荷相互作用，ＳｃＧＦＰ可以與ＧＡＧｓ結(jié)合。ＧＡＧｓ的存逡逑在就會抑制ＧＯ對ＳｃＧＦＰ的淬滅作用，與沒有加入ＧＡＧｓ的陰性對照相比出現(xiàn)逡逑熒光恢復(fù)現(xiàn)象，并且這種抑制作用與樣本中ＧＡＧｓ的濃度呈現(xiàn)出較好劑量依賴逡逑關(guān)系。所以根據(jù)這一檢測原理，我們以ＳｃＧＦ

２．３．２邋ＧＯ對ＳｃＧＦＰ的熒光淬滅作用逡逑為檢測ＧＯ對ＳｃＧＦＰ的熒光淬滅作用，在５明／ｍｌ的ＳｃＧＦＰ溶液中加入不逡逑同終濃度的ＧＯ，檢測熒光強(qiáng)度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖２－３）可以看出，加入ＧＯ后逡逑ＳｃＧＦＰ的熒光強(qiáng)度顯著降低，并且隨著ＧＯ濃度的增加ＳｃＧＦＰ的熒光強(qiáng)度逐漸逡逑降低。當(dāng)加入１０邋Ｈ丨的ｌｍｇ／ｍｌ邋ＧＯ時(shí)，檢測熒光值微弱，熒光強(qiáng)度可以淬滅高逡逑達(dá)９５．２％，因此可以選用終濃度為５０噸／ｍｌ的ＧＯ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ＧＯ對于ＳｃＧＦＰ逡逑的熒光淬滅作用主要是由于它們之間的能量共振轉(zhuǎn)移造成的，ＧＯ的這種高淬滅逡逑能力可以有效的降低檢測背景值，提高檢測的靈敏度，將更加有利于ＧＡＧｓ的分逡逑３６逡逑

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