【摘要】：蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)是巰基氧化還原酶,屬于硫氧還原蛋白超家族。PDI的結(jié)構(gòu)中主要包含兩個酶催化活性域a、a’,其活性位點為CGHC;兩個底物結(jié)合域b、b’以及C末端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號KDEL。PDI主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)上是蛋白質(zhì)折疊所需的氧化還原酶。PDI的表達變化或者酶活性的失調(diào)與一系列的疾病相關(guān),如神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病。除了作為可溶性氧化還原酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,PDI也存在于細胞外側(cè),PDI可以分泌或轉(zhuǎn)運到細胞表面,細胞膜表面的PDI參與調(diào)節(jié)多種重要的生理過程,包括血小板活化、血栓形成、T細胞遷移及骨質(zhì)瘤遷移等。疼痛是由軀體感覺神經(jīng)元外周突觸末梢感受各種傷害性刺激(溫度刺激、機械刺激和化學刺激等),并將其轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動向中樞傳遞,而引起的痛感覺。痛覺可作為機體受到傷害的一種警告,引起機體一系列防御性保護反應。軀體感覺神經(jīng)元的胞體在背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG),其神經(jīng)末梢數(shù)量龐大支配各種周圍組織包括皮膚、關(guān)節(jié)、呼吸道等。DRG神經(jīng)元作為軀體感覺初級傳入神經(jīng)元,在痛覺信號傳導過程中發(fā)揮著極其重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)DRG神經(jīng)元不僅具有痛覺信號形成和傳遞作用,而且還兼具痛覺信號調(diào)節(jié)作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)在疼痛模型中背根神經(jīng)節(jié)DRG和脊髓中的PDI表達升高,使用PDI抑制劑可以使小鼠的痛閾值升高,緩解小鼠的疼痛癥狀。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn),特異性敲除DRG組織Nav1.8陽性神經(jīng)元上的PDI可以緩解由緩激肽(BK)誘發(fā)的小鼠急性炎性疼痛癥狀。為了進一步證實PDI與疼痛的關(guān)聯(lián),本論文旨在探究PDI在背根神經(jīng)節(jié)DRG組織中的特征性分布和分泌情況,以及PDI蛋白在慢性疼痛中的變化及其發(fā)揮的作用。第一部分PDI在小鼠背根神經(jīng)節(jié)DRG的分布及其對小鼠急性疼痛行為的影響目的:分析背根神經(jīng)節(jié)DRG中PDI的分布特性及分泌情況,同時探究外源性給予PDI對小鼠疼痛行為的影響。方法:(1)使用冰凍切片和免疫熒光技術(shù)觀察PDI與DRG組織相關(guān)Marker基因如IB4,CGRP,NF200的共表達情況。(2)應用ELISA試劑盒檢測DRG組織PDI的分泌情況。(3)應用流式細胞術(shù)檢測DRG神經(jīng)元表面PDI的存在。(4)制備重組蛋白二硫鍵異構(gòu)酶hPDI和突變蛋白PDIoooo。應用SDS-PAGE方法檢測重組蛋白的純度。以Di-E-GSSG為底物檢測重組蛋白的還原活性。(5)將hPDI和PDIoooo分別注射到野生型小鼠的右后腳掌,觀察注射前和注射后第1、3、5、24h,小鼠對熱刺激和機械刺激的反應閾值。結(jié)果:(1)通過免疫熒光方法,我們觀察到PDI與IB4,CGRP,NF200陽性DRG神經(jīng)元均有一定程度的共定位。其中神經(jīng)絲蛋白(NF200)用來標記大直徑DRG神經(jīng)元;降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是特異性表達在肽類小細胞神經(jīng)元上的分子標記物;植物凝集素(IB4)是非肽類小細胞神經(jīng)元的分子標記物。我們的實驗結(jié)果提示PDI在DRG大、中、小神經(jīng)元中均有表達。(2)應用ELISA試劑盒檢測DRG組織PDI的分泌情況。從實驗結(jié)果中可以看出DRG組織可以分泌PDI,與對照組(普通DRG外液刺激)相比,High K~+和BK的刺激沒有使PDI的分泌量增加或者降低。(3)應用流式細胞術(shù)檢測DRG神經(jīng)元表面的PDI。從實驗結(jié)果中可以看出DRG神經(jīng)元表面確有PDI的存在,High K~+刺激沒有改變神經(jīng)元表面PDI的含量,陽性細胞率和平均熒光強度與對照組(普通DRG外液刺激)相比均沒有顯著性差異。(4)重組蛋白二硫鍵異構(gòu)酶hPDI和PDIoooo的制備、純度及活性檢測。體外擴增大腸桿菌制備重組蛋白hPDI和PDIoooo,濃度分別為7.50mg/ml和8.22 mg/ml;SDS-PAGE檢測hPDI和PDIoooo純度分別為90%和85%;hPDI有較強的還原活性而突變蛋白PDIoooo基本沒有活性。(5)重組蛋白PDI對小鼠行為學的影響。行為學結(jié)果顯示,與注射PDIoooo的對照組小鼠相比,注射hPDI后使小鼠的熱刺痛閾值明顯降低,并且呈現(xiàn)明顯的組間差異,尤其在第3h和第5h對熱刺激變得更敏感與對照組相比有統(tǒng)計學差異。而注射hPDI的小鼠在第5h和第24h對機械刺激變得更敏感與對照組相比有統(tǒng)計學差異,但組間比較與對照組無明顯組間差異。結(jié)論:以上實驗結(jié)果表明:1.PDI在DRG各類神經(jīng)元中均有高表達;2.PDI可以分泌到DRG神經(jīng)元外;3.外源給予PDI可誘發(fā)小鼠的疼痛過敏行為(尤其是熱痛過敏)。第二部分慢性疼痛模型中DRG中PDI的表達變化及其對小鼠疼痛行為的影響目的:研究DRG中PDI蛋白在小鼠慢性炎性疼痛及慢性神經(jīng)病理性疼痛中變化情況及其在慢性疼痛中發(fā)揮的作用。方法:(1)制備CFA慢性炎性疼痛模型并檢測DRG中PDI蛋白變化:實驗組小鼠(野生型小鼠)后腳掌注射CFA(25μl),對照組小鼠注射生理鹽水(25μl)。注射后第3、5、7天提取小鼠L3、L4和L5的DRG,進行Western-Blot實驗,檢測PDI蛋白的變化情況。(2)制備CCI慢性神經(jīng)病理性疼痛模型并檢測DRG中PDI蛋白變化:實驗組小鼠(野生型小鼠)用羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng),假手術(shù)組小鼠只進行平行手術(shù),但不結(jié)扎坐骨神經(jīng)。手術(shù)后第5、7、10天提取小鼠L3、L4和L5的DRG,進行Western-Blot實驗,檢測PDI蛋白的變化情況。(3)使用SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠制備CFA慢性炎性疼痛模型,應用熱刺痛儀和Von Frey纖維刺痛針,測定SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠(實驗組)和PDI~(fl/fl)小鼠(對照組)在注射CFA前1天和注射后第1、3、5、7、9、11、13、15天的熱刺痛閾值和機械刺痛閾值。(4)使用SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠制備CCI慢性神經(jīng)病理性疼痛模型,應用熱刺痛儀和Von Frey纖維刺痛針,測定SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠(實驗組)和PDI~(fl/fl)小鼠(對照組)在CCI手術(shù)前1天和手術(shù)后第1、3、5、7、10、14天的熱刺痛閾值和機械刺痛閾值。(5)完成Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠的繁殖和基因型鑒定后,小鼠8周齡時連續(xù)四天腹腔注射2 mg Tamoxifen誘導DRG神經(jīng)元中PDI的條件性敲除,使用Western-Blot技術(shù)檢測PDI的敲除效率。(6)Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠(實驗組)和PDI~(fl/fl)小鼠(對照組)的右后腳掌注射CFA(25μl)制備慢性炎性疼痛模型。應用熱刺痛儀和Von Frey纖維刺痛針,測定Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠在給藥前1天和給藥后第1、3、5、7、10、14天的熱刺痛閾值和機械刺痛閾值。結(jié)果:(1)在注射CFA后第3,5,7天野生型小鼠DRG組織中PDI蛋白表達上調(diào),與生理鹽水注射組DRG內(nèi)PDI表達量比值分別為1.22±0.04、1.78±0.23和1.79±0.14,CFA組與生理鹽水組相比具有統(tǒng)計學差異。(2)在CCI手術(shù)后第5,7,10天野生型小鼠DRG組織PDI蛋白表達上調(diào),與假手術(shù)組DRG內(nèi)PDI表達量比值分別為1.52±0.04、1.32±0.07和1.30±0.07,CCI組與假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計學差異。(3)SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在CFA模型中的行為學結(jié)果:SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在給藥后第5、7、9、11、13天熱刺痛閾值升高,與PDI~(fl/fl)小鼠相比有顯著性差異,并且呈現(xiàn)明顯的組間差異。而SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠只在第13天對機械刺激變得更敏感,與PDI~(fl/fl)小鼠相比有顯著性差異,但組間比較無顯著性差異。(4)SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在CCI模型中的行為學結(jié)果:SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠在CCI手術(shù)后第7、10天熱刺痛閾值升高,與PDI~(fl/fl)小鼠相比有顯著性差異,并且呈現(xiàn)明顯的組間差異。而SNS-Cre,PDI~(fl/fl)小鼠與PDI~(fl/fl)小鼠相比對機械刺痛閾值并無明顯差異,組間比較也無顯著性差異。(5)Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)轉(zhuǎn)基因小鼠的交配繁殖和基因型鑒定及敲除效率鑒定:將Advillin-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠與PDI~(fl/+)轉(zhuǎn)基因小鼠交配得到Advillin-CreERT2,PDI~(fl/+)雜合子小鼠后,再與PDI~(fl/+)小鼠交配得到Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠。小鼠出生后兩周,剪腳趾標記,剪鼠尾提取基因組DNA,通過PCR擴增和凝膠電泳檢測目的DNA條帶。Cre基因的目的條帶約180 bp,PDI的WT條帶約480 bp,PDI的Flox條帶(插入loxP位點的目的條帶)約550 bp。DRG神經(jīng)元中PDI的敲除效率:Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠8周齡時連續(xù)四天腹腔注射2 mg Tamoxifen誘導PDI敲除,分離Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠和PDI~(fl/fl)小鼠的DRG提取蛋白,使用Western-Blot技術(shù)檢測PDI的敲除效率。結(jié)果表明,與PDI~(fl/fl)小鼠相比Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠DRG組織PDI蛋白量略有降低。(6)Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠在CFA模型中的行為學結(jié)果:在CFA慢性炎性疼痛模型中,Advillin-CreERT2,PDI~(fl/fl)小鼠的熱刺痛閾值有升高的趨勢,但與PDI~(fl/fl)小鼠相比,沒有顯著性差異。兩組小鼠的機械刺痛閾值也無顯著性差異。結(jié)論:1.在CFA慢性炎性疼痛模型和CCI慢性神經(jīng)病理疼痛模型中DRG組織PDI的蛋白表達量升高;2.DRG痛覺神經(jīng)元特異性敲除PDI可以緩解小鼠慢性炎性疼痛癥狀及神經(jīng)病理性疼痛癥狀。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R402
【圖文】：

數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 軟件，統(tǒng)計方法為兩樣本 t 檢驗，t'檢驗，配對驗和單因素重復測量方差分析，圖像處理和排版采用 OriginPro 8 lustrator CS6 軟件。結(jié) 果1.PDI 在背根神經(jīng)節(jié) DRG 的分布情況腹腔注射 1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，4%多聚甲醛心臟灌流，提取野小鼠 DRG 組織，制備冰凍切片，進行免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡行觀察。從實驗結(jié)果中（Fig.1），我們觀察到 PDI 分別與植物凝集素IB4）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）以及神經(jīng)絲蛋白（NF200）有很度的共表達。上述結(jié)果提示 PDI 在 DRG 大中小神經(jīng)元中均有表達。

CGRP and NF200. Arrows indicate examples of co-localiza bars were labeled on the left in each panel2.PDI 在背根神經(jīng)節(jié) DRG 的分泌情況（1）ELISA 試劑盒檢測 DRG 組織 PDI 的分泌情況將野生型小鼠頸椎脫臼處死，提取左右兩側(cè) DRG 分別置于 DRG高 K+DRG 外液（CK+= 150mM）中，室溫孵育 30 min，離心取上為樣品溶液，使用 ELISA 試劑盒檢測樣品溶液中 PDI 的含量。取右兩側(cè) DRG 分別置于 DRG 外液、BK（100 μM）溶液中，室溫孵in，離心取上清液作為樣品溶液，使用 ELISA 試劑盒檢測樣品溶DI 的含量。ELISA 結(jié)果顯示高 K+（Fig.2A）和 BK（Fig.2B）的刺有使胞外 PDI 的含量發(fā)生改變（paired t-test，P > 0.05）。

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本文編號：2739293