【摘要】：在世界范圍內(nèi),由腸炎沙門菌(Salmonella enterica serovor Entteritidis,S.Enteritidis)導(dǎo)致的沙門菌病是一種重要的食源性傳染病。腸炎沙門菌能夠?qū)е虑蓊惖陌l(fā)病及死亡,在感染種雞后,常表現(xiàn)為隱性帶菌而不發(fā)病,該菌能夠感染人類和其他多種動物,是一種重要且危害嚴重的人獸共患病原菌�？咕幬锏氖褂檬欠乐文c炎沙門菌感染的重要手段之一,而腸炎沙門菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播則極大地制約了抗菌藥物的使用效果。耐藥基因的產(chǎn)生和傳播是腸炎沙門菌耐藥性的重要分子機制之一,高通量測序技術(shù)的發(fā)展和突破為研究耐藥性的分子機制提供了極大的便利。本研究通過對190株腸炎沙門菌的全基因組重測序研究,探討高通量測序技術(shù)在腸炎沙門菌耐藥性研究中的應(yīng)用,分析我國腸炎沙門菌的分子耐藥機制和演化規(guī)律。一、腸炎沙門菌的生物辨識利用生物信息學(xué)技術(shù)對190株分離菌株的全基因組測序raw reads進行質(zhì)量控制與拼接,得到組裝長序列,將最終assembly文件作為全基因組數(shù)據(jù)材料進行后續(xù)分析。首先使用MicrobeTrakr在線工具鑒定種屬,190株測序菌株均為沙門菌屬。然后使用sistr_cmd軟件鑒定測序菌株血清型,均為腸炎沙門菌。最后使用PubMLST工具鑒定其ST型,除SAL0000131和SAL0000132兩株為新型以外,其余均為ST11,符合腸炎沙門菌的ST型特征,而SAL0000131和SAL0000132的aroC基因的突變是導(dǎo)致該兩株菌株表現(xiàn)為新ST型的原因。二、腸炎沙門菌的耐藥基因與耐藥性對190株腸炎沙門菌進行耐藥表型測定,腸炎沙門菌對NAL的耐藥率最高,為83.7%,對 AMP 和 AMC 的耐藥性分別達到 62.6%和 62.1%,對 CFZ(41.6%)、STR(45.8%)、SXT(29.5%)和TET(21.6%)的耐藥菌株也較多,其他藥物的耐藥菌株數(shù)量較少,AMK甚至沒有任何菌株表現(xiàn)為耐藥。在不同宿主中,43株人源腸炎沙門菌不僅有非常寬的耐藥譜,其耐藥水平也相當高,整體耐藥情況最復(fù)雜,多重耐藥率達到65.1%,且多重耐藥菌株的耐藥譜非常寬,其中NAL耐藥率最高,達到81.4%;對AMP、AMC和CFZ的耐藥率均超過50%,分別達到62.8%、65.1%和53.5%;對ATM和STR的耐藥率較高,分別達到23.3%和 37.2%;對 KAN、GEN、TET、SXT、CHL 和 OLA 的耐藥率較低,分別達到 16.3%、16.3%、16.3%、11.6%、11.6%和 9.3%;CIP 和 ENR 的耐藥率僅有 2.3%和 4.7%;對 MEM、AMK和NIT無耐藥菌株。雞源腸炎沙門菌耐藥譜較寬,耐藥率較高,耐藥水平較高,整體耐藥情況較為復(fù)雜,其中NAL耐藥率最高,為94.3%,MIC50達到512μg/ml;其次為AMP、AMC、CFZ 和 STR,耐藥率分別達到 69.9%、68.3%、42.3%和 52.0%;SXT 和 TET的耐藥率較高,分別為31.7%和25.6%;其余藥物的耐藥率則較低,均不超過10%;AMK沒有任何耐藥菌株。其余宿主腸炎沙門菌數(shù)量較少,其耐藥率遠低于人源與雞源腸炎沙門菌。使用blast軟件將組裝序列與ResFinder數(shù)據(jù)庫比對,共檢測到50種耐藥相關(guān)基因,分別為 aadA1、aadA2、aadA5、aadA16、aadA22、aac(6')Ib-cr、aac(3)-Iva、aac(3)-IId、aph(3')-IIa、aph(3)-Ia、aph(3')-Ic、aph(4)-la、aph(3)-Iva、arr-3、blaTEM-1、blaCTx-M-3、blacrx-M-14、blaCTX-M-55、blacTX-M-65、blaoXA-1、blaNDM-5、blaMIR-2、blaMIR-6、blacMY-2、catA1、catB、catB3、cmlA1、dfrA1、dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27、ermB、fosA、floR、lnuF、mefB、mphA、oqxA、oqxB、qnrA7、strA、sul2、sul1、sul3、tetA、tetB和tetC。去除相似度低于80%和覆蓋度低于70%的基因,得到與表型試驗相關(guān)的耐藥基因共計35種,分別為β-內(nèi)酰胺類耐藥相關(guān)基因 7 種(bfaTEM-1、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaCTX-M-65、blaoXA-1和blaCMY-2),氨基糖苷類耐藥相關(guān)基因13種(strA、strB、aadA1、aadA4、aadAB、aadA16、aadA22、aac(3)-IId、aph(3')-Ila、aph(3')-Ia、aph(4)-Ia、aph(3)-Iva和aac(6')Ib-cr),喹諾酮類耐藥相關(guān)基因3種(qnrA7、oqxA、oq萬),四環(huán)素類耐藥相關(guān)基因2種(tetA和tetC),磺胺類耐藥相關(guān)基因3種(sul1、sul2和sul3),三甲氧芐二氨嘧啶類相關(guān)耐藥基因3種(dfrA1、dfrA17和dfrA27)以及酰胺醇類耐藥相關(guān)基因4種(catB3、catB、floR和cmLA1)�；蛐团c表型對應(yīng)關(guān)系良好,blaTEM-1基因與青霉素類藥物AMP和AMC的對應(yīng)率達到96.1%和95.1%,strA基因和strB基因與氨基糖苷類藥物STR的對應(yīng)率達到90.9%,tetA基因與四環(huán)素類藥物四環(huán)素對應(yīng)率達到82.9%,dfrA17基因與磺胺類藥物復(fù)方新諾明的對應(yīng)率達到88.9%,catB3、catB、floR和cmlA1與酰胺醇類藥物CHL對應(yīng)性達到了 100%,均表現(xiàn)出優(yōu)良的對應(yīng)性,但仍然存在表型與基因型不對應(yīng)的情況,說明仍然有未知的耐藥機制在發(fā)揮作用。基因的點突變研究顯示,基因點突變確實能夠影響耐藥表型。blarEM-1基因的A120C突變在6株腸炎沙門菌中被檢測到,該6株菌株中的5株表現(xiàn)出頭孢唑林的高耐藥表型(MIC≥512μg/ml)。strA中檢測到2種非共有點突變(C295T和G445C),未發(fā)現(xiàn)其對表型存在顯著影響。strB檢測到11種非共有點突變(A139G、T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C、G364C、T535G、G592T 和 G574T),其中 T332C、T334C、T343G、T345C、C358G、T361C和G364C在基因序列上的位置相當接近。tetA基因中共檢測到10中非共有點突變,其中發(fā)生A124G突變的YZU0232和YZU0266的四環(huán)素耐藥表型均為不耐藥,該突變可能對tetA基因功能有減弱作用,發(fā)生G250A(SAL0000212和YZU0228)和G277A(YZU0254)的菌株表現(xiàn)出的MIC水平達到耐藥突破點的8倍,該兩種點突變可能對耐藥性有提高作用。喹諾酮類藥物的耐藥性產(chǎn)生與QRDR的點突變具有關(guān)聯(lián),并且由于各基因之間、各點突變之間的相互配合導(dǎo)致不同的耐藥表型和水平。在質(zhì)粒檢測分析中發(fā)現(xiàn)IncX1型質(zhì)粒攜帶有眾多耐藥基因,可能與腸炎沙門菌的耐藥流行有密切關(guān)聯(lián)。對不同質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)95個IncX1型質(zhì)粒攜帶了 77個strA基因中的76個、77個strB基因中的76個、77個sul2基因中的76個、35個tetA基因中的31個和103個blaTEM-1基因中的95個,IncX1型質(zhì)粒主要攜帶的基因為str4、strB、sul2、tetA和blaTEM-1,與氨基糖苷類、磺胺類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性相關(guān),而其余質(zhì)粒均不攜帶耐藥基因,顯示IncX1型是腸炎沙門菌耐藥基因流行的關(guān)鍵性可移動元件。三、腸炎沙門菌的進化與耐藥性研究使用Parsnp軟件對190株腸炎沙門菌作核心基因組進化樹,并與背景信息對應(yīng)分析。MIC表型、耐藥基因型和質(zhì)粒分型在進化關(guān)系上呈現(xiàn)出明顯的譜系差異,核心基因組進化樹的構(gòu)建所產(chǎn)生的不同分支能夠與耐藥相關(guān)背景信息較為準確清晰的對應(yīng)。使用Parsnp軟件對國內(nèi)外共計208株腸炎沙門菌進行核心基因組進化樹構(gòu)建,結(jié)果顯示國內(nèi)菌株與美國、加拿大、韓國、莫斯科、丹麥和巴西的菌株在進化樹上可以明顯區(qū)分,國外菌株處于獨立分支且能夠按照宿主和年代來源形成較為明確的譜系。國內(nèi)腸炎沙門菌的流行則由兩部分組成,其一為國內(nèi)流行的腸炎沙門菌,其二可能是來自于美國和加拿大等北美國家的腸炎沙門菌。根據(jù)國內(nèi)外菌株的進化關(guān)系對比分析,國內(nèi)腸炎沙門菌的進化結(jié)構(gòu)比國外菌株更為復(fù)雜,國內(nèi)各宿主、地區(qū)的腸炎沙門菌在進化關(guān)系上非常接近,而非國外菌株所表現(xiàn)出的不同譜系,可能意味著國內(nèi)腸炎沙門菌的流行范圍更大,宿主間的菌株交流更頻繁。基于全基因組重測序的進化分析在一定程度上能夠?qū)δc炎沙門菌耐藥性作出預(yù)測和指導(dǎo)。
【圖文】：

序深度邐圖１文庫構(gòu)建示意圖逡逑，對后邐Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｐ—ａｒａｔｉｏｎ逡逑讀長以１５0ｂｐ或２５０ｂｐ為常用。逡逑示。測序反應(yīng)在邋ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ邋中進行，ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ逡逑碎后的短序列片段。短片段通過ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ逡逑合在ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ中的ｌａｎｅ上。每個ｆｌｏｗ邋ｃｅｌｌ逡逑ｎｅ，能夠同時■并彳亍的進彳亍測序反應(yīng)。使用逡逑酶進行ＰＣＲ反應(yīng)，待測片段經(jīng)過重復(fù)擴增，逡逑片段，通過變性操作使雙鏈片段解鏈成為逡逑且再錨定到固相表面的其他區(qū)域，根據(jù)需逡逑數(shù)，于是在ｆｌｏｗ邋Ｃｅｌｌ中得到大量雙鏈待測逡逑ａｎｅ的總表面積。逡逑

邐基于全基因組重測序的（Ａ）文庫的構(gòu)建（Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）逡逑如圖１所示。將基因組打斷成為短序列片在片段的兩頭連接上特定的接頭（Ａｄａｐｔｏｒ），人工設(shè)計的堿基序列，發(fā)揮錨定功能。若為轉(zhuǎn)錄則需要首先對序列進行反轉(zhuǎn)工作。片段的大ｓｉｚｅ）將會直接影響后續(xù)的信息學(xué)分析，故而組測序，首先要確定片段化的大小，從而使得段組裝（Ａｓｓｅｍｂｌｙ）工作更加準確。在固定的下，過長的測序讀長會導(dǎo)致測序序列的質(zhì)量下續(xù)組裝和信息學(xué)工作帶來困難，，因此目前的測（Ｂ）簇擴增（ＣｌｕｓｔｅｒＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）逡逑Ｃｌｕｓｔｅｒ邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邐如圖邋２邋功能為結(jié)合
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黎劍華;夏偉;卓菲;楊貴清;;由腸炎沙門菌引起的食物中毒的調(diào)查分析[J];當代醫(yī)學(xué);2016年36期

2 沈菁;從一例患兒血中分離出腸炎沙門菌[J];廣西預(yù)防醫(yī)學(xué);2005年03期

3 金晶;;腸炎沙門菌不同檢測方法比較[J];中國校醫(yī);2018年02期

4 武國威,賈麗,李平;腸炎沙門菌致老年患者急性泌尿系統(tǒng)感染[J];齊魯醫(yī)學(xué)檢驗;2005年01期

5 鄭東宇;馬愷;周翌婧;唐震;;2012-2015年江蘇省食源性腸炎沙門菌同源性分析[J];江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué);2018年03期

6 蔣艷鳳;唐秀娟;蔣夙君;;一起腸炎沙門菌引起食物中毒的實驗室檢測[J];應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué);2017年02期

7 謝益君;陳米娜;金圓;徐景野;;腸炎沙門菌食物中毒調(diào)查與溯源報告[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2014年07期

8 劉南,曹俊杰,胡宏;分離腸炎沙門菌價廉有效的方法[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;2000年06期

9 張海艷;周贊虎;胡元慶;劉斌;;腸炎沙門菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法的建立[J];檢驗檢疫學(xué)刊;2017年06期

10 盛冬萍;劉安平;潘剛雷;陳米娜;楊元斌;徐景野;;一起腸炎沙門菌食物中毒報告[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年04期

相關(guān)會議論文 前7條

1 王琳娜;;由腸炎沙門菌引起的食物中毒[A];2006中國微生物學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

2 翟賢月;焦揚;孟闖;耿士忠;潘志明;焦新安;;減毒腸炎沙門菌C50336△sptP△rfbG缺失株的構(gòu)建與鑒定[A];中國毒理學(xué)會獸醫(yī)毒理學(xué)委員會與中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會暨中國毒理學(xué)會獸醫(yī)毒理學(xué)委員會第5次全國會員代表大會會議論文集[C];2017年

3 張麗娟;;腸炎沙門菌致小腿膿腫一例[A];第一次全國中西醫(yī)結(jié)合檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

4 潘丹妮;劉勇;;腸炎沙門菌對喹諾酮類藥物耐藥性及耐藥機制研究[A];第一次全國中西醫(yī)結(jié)合檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

5 曹俊;劉松艷;周薇;司微;王曼宇;張童利;劉思國;于申業(yè);;腸炎沙門菌延伸因子EF-Tu缺失株對環(huán)境壓力的應(yīng)答變化[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第十二次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2016年

6 沈麗珍;陳素菜;張愛鳴;張穎;林建芬;陳伊惠;;2010-2013年感染性腹瀉患者的細菌性病原構(gòu)成及耐藥分析[A];紀念中國微生物學(xué)會臨床微生物學(xué)專業(yè)委員會成立五周年-第五屆中國臨床微生物學(xué)大會暨臺灣海峽兩岸微生物學(xué)與免疫學(xué)論壇論文匯編[C];2014年

7 朱春紅;孫曉慶;何素芬;朱國強;;基于Red同源重組和高效自殺性載體系統(tǒng)構(gòu)建腸炎沙門菌突變株方法的比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 藺志杰;腸炎沙門菌效應(yīng)蛋白AvrA參與宿主炎性反應(yīng)機制[D];揚州大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 強斌;基于全基因組重測序的腸炎沙門菌耐藥性研究[D];揚州大學(xué);2018年

2 田雅楠;不同源腸炎沙門菌耐藥表型與耐藥基因型分析[D];揚州大學(xué);2017年

3 李金鑫;不同地區(qū)沙門菌的流行病學(xué)調(diào)查及腸炎沙門菌SDBL-1分離株的致病性和傳播途徑探究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 陳韻;腸炎沙門菌轉(zhuǎn)錄因子SEN2967和SEN3610調(diào)控基因的篩選與鑒定[D];揚州大學(xué);2017年

5 劉謝;廣東省2007-2013年腸炎沙門菌耐藥特征和分子分型研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 劉志成;利用IVIAT篩選腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子[D];揚州大學(xué);2011年

7 任思琪;環(huán)丙沙星壓力下鼠傷寒和腸炎沙門菌的適應(yīng)性研究[D];華南農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 王曉春;腸炎沙門菌lpfC和stdB基因缺失株的構(gòu)建及其相關(guān)功能的初步研究[D];揚州大學(xué);2015年

9 王勇祥;腸炎沙門菌和雛沙門菌fimH基因缺失株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析[D];揚州大學(xué);2015年

10 武利平;光纖倏逝波生物傳感器快速檢測水中沙門菌和腸炎沙門菌的方法研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2014年

本文編號：2702575