發(fā)布時(shí)間：2020-06-05 19:12

【摘要】：鑒于人體免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性,當(dāng)前癌癥早期篩查和臨床疾病診斷需要同時(shí)檢測(cè)多種疾病標(biāo)志物�；诳贵w陣列的多組分化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)由于能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏度、高通量、寬線(xiàn)性范圍、實(shí)時(shí)、原位及在體的檢測(cè),日益受到人們的青睞。然而,當(dāng)前化學(xué)發(fā)光多組分免疫分析法存在需要標(biāo)記、分離及多次洗滌步驟,操作繁瑣,試劑消耗量大,耗時(shí)等問(wèn)題。無(wú)標(biāo)記免疫分析無(wú)需預(yù)先標(biāo)記,也無(wú)需分離步驟,有效地避免了抗原或抗體因標(biāo)記、分離及多次洗滌過(guò)程而導(dǎo)致活性降低等問(wèn)題,具有試劑消耗量少,分析速度快,操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。相較于化學(xué)發(fā)光分析體系中常用的天然酶,有著過(guò)氧化物酶活性的納米材料具有優(yōu)良的催化活性,制備簡(jiǎn)便,性質(zhì)穩(wěn)定,可調(diào)控性等優(yōu)勢(shì)。因此本論文提出了基于多種新型納米酶?jìng)鞲嘘嚵械臒o(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像多組分免疫分析(CLI-MIA)新策略和新方法�；诩{米酶?jìng)鞲嘘嚵械腃LI-MIA策略集成了納米酶的低成本、穩(wěn)定性和可調(diào)控性,化學(xué)發(fā)光測(cè)定的高靈敏度,免疫分析的高特異性以及抗體陣列基于的電感耦合CCD成像高檢測(cè)通量等優(yōu)勢(shì)。本論文合成了金屬氫氧化物納米籠、中空雙金屬納米球、多孔雙金屬核殼納米材料和金屬有機(jī)框架衍生物納米八面體材料,探究其過(guò)氧化物酶活性,并應(yīng)用于構(gòu)建無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像多組分免疫傳感器陣列,實(shí)現(xiàn)了無(wú)標(biāo)記、高通量、高靈敏、低消耗、可靠和快速的多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。具體研究工作如下:(1)本研究提出了基于3D Cu(OH)_2超籠納米酶的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像多組分免疫分析新策略,旨在實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多腫瘤標(biāo)志物。通過(guò)低能耗的綠色合成程序,由1DCu(OH)_2納米帶自組裝形成的3D Cu(OH)_2超籠具有優(yōu)良的過(guò)氧化物酶活性。將分散在殼聚糖中的3D Cu(OH)_2超籠捕獲到環(huán)氧官能化微孔陣列中制成納米酶?jìng)鞲薪缑�。生物功能化�?fù)合物具有較大的反應(yīng)表面積和優(yōu)異的生物相容性,因此基于鏈霉親和素對(duì)生物素化抗體的高度選擇性識(shí)別,從而使得多種抗體能夠被有效地固定在納米酶?jìng)鞲嘘嚵兄�。與相應(yīng)的抗原在線(xiàn)溫育后,形成的免疫復(fù)合物會(huì)阻礙化學(xué)發(fā)光底物向3D Cu(OH)_2超籠納米酶?jìng)鞲薪缑娴臄U(kuò)散通道,最終導(dǎo)致CLI信號(hào)的降低。通過(guò)收集陣列中的每個(gè)傳感微孔的CLI信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)多組分定量檢測(cè)。以AFP,CEA,CA125為模型聯(lián)合標(biāo)志物組,CLI免疫傳感陣列檢測(cè)的線(xiàn)性范圍分別為 0.0010-100 ng/mL(AFP),0.0010-75 ng/mL(CEA),0.0010-200 U/mL(CA125),檢測(cè)限低至 0.16pg/mL(AFP),0.20pg/mL(CEA),1.7×10~(-4)U/mL(CA 125)。本工作提出的基于3D Cu(OH)_2超籠納米酶的無(wú)標(biāo)記CLI-MIA新策略,具有高通量、超靈敏、低消耗等優(yōu)勢(shì),為癌癥大規(guī)模癌癥篩查與聯(lián)合準(zhǔn)確診斷提供了新思路和新平臺(tái)。(2)本研究提出一種基于多孔PtAg雙金屬納米酶的化學(xué)發(fā)光成像多組分免疫分析新方法,用于在無(wú)標(biāo)記的模式下同時(shí)檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物,具有優(yōu)良的靈敏度、超高的檢測(cè)通量及可接受的穩(wěn)定性。本工作制備的PtAg納米顆粒(PtAgNPs)為多孔核殼納米八面體結(jié)構(gòu),具有本征的過(guò)氧化物酶以及氧化酶雙功能酶活性,并且能夠維持長(zhǎng)時(shí)間的催化活性。這種無(wú)標(biāo)記多元測(cè)定可以通過(guò)簡(jiǎn)單的策略輕松實(shí)現(xiàn)。首先將多孔PtAgNPs包埋于環(huán)氧硅烷化傳感陣列的微孔中制成納米酶?jìng)鞲薪缑�。然后用鏈霉親和素功能化PtAgNPs捕獲多組分生物素化抗體。當(dāng)溫育上相對(duì)應(yīng)的抗原后,所形成的免疫復(fù)合物會(huì)阻礙多孔PtAgNPs納米酶對(duì)化學(xué)發(fā)光底物的催化反應(yīng)。通過(guò)電感耦合CCD照相機(jī)積分收集陣列中不同區(qū)域的化學(xué)發(fā)光亮度,從而實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)CA 125,CEA和AFP�；诙嗫譖tAg雙金屬納米酶的無(wú)標(biāo)記 CLI-MIA 方法在 0.0010-80 U/mL(CA 125)、0.0010-75 ng/mL(CEA)和0.0010-80ng/mL(AFP)的濃度范圍內(nèi)顯示出良好的線(xiàn)性,檢測(cè)限為1.3×10~(-4)U/mL(CA 125)、0.10 pg/mL(CEA)和0.13 pg/mL(AFP)。無(wú)標(biāo)記CLI-MIA陣列具備良好的實(shí)際樣品的檢測(cè)能力,并表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性和特異性。(3)本研究提出了一種基于中空PdNi納米球(PdNi hNPs)的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光發(fā)光成像多組分免疫分析(CLI-MIA)新方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌的聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物組的同時(shí)檢測(cè)。PdNi hNPs具有氧化酶和過(guò)氧化物酶的雙酶活性。利用PdNi hNPs的優(yōu)良過(guò)氧化物酶活性,將PdNi hNPs包埋于環(huán)氧基硅烷化微孔陣列中制成納米酶?jìng)鞲嘘嚵小Ｈ缓笸ㄟ^(guò)鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)固定多種生物素化抗體,利用牛血清蛋白封閉未反應(yīng)活性位點(diǎn)后,在相應(yīng)位點(diǎn)溫育上多種抗原�？乖�-抗體復(fù)合物會(huì)阻礙PdNi hNPs納米酶對(duì)化學(xué)發(fā)光底物的催化作用,導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號(hào)值下降。通過(guò)電感耦合CCD照相機(jī)積分收集不同區(qū)域的發(fā)光亮度,實(shí)現(xiàn)了對(duì)多腫瘤標(biāo)志物的無(wú)標(biāo)記、高通量、快速的檢測(cè)。從微孔區(qū)域積分收集的化學(xué)發(fā)光成像亮度值與腫瘤標(biāo)志物濃度的對(duì)數(shù)值作圖,可得到對(duì)多種標(biāo)志物檢測(cè)的工作曲線(xiàn)�；� PdNi hNPs 納米酶?jìng)鞲嘘嚵械?CLI-MIA 策略在 0.0050-75 ng/mL,0.0010-100 U/mL和0.0010-240 U/mL范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)CEA,CA 125,CA 15-3同時(shí)檢測(cè),并能成功應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)。本工作提出的無(wú)標(biāo)記CLI-MIA可簡(jiǎn)便地用于癌癥早期篩查與臨床診斷,具備很好的臨床應(yīng)用潛力。(4)本研究以Cu-BTC為前驅(qū)體合成了 Cu/CuO/Cu_2O納米八面體金屬有機(jī)框架材料(MOFs)衍生物,首次探究發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)異的過(guò)氧化物酶活性,并應(yīng)用于構(gòu)建化學(xué)發(fā)光成像多組分免疫分析新方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)多腫瘤標(biāo)志物的無(wú)標(biāo)記、超靈敏、高通量檢測(cè)�；诩{米酶的無(wú)標(biāo)記多元測(cè)定可通過(guò)簡(jiǎn)單的制作過(guò)程實(shí)現(xiàn)。首先,將殼聚糖分散的Cu/CuO/Cu_2O納米酶包埋于環(huán)氧基硅烷化微孔陣列中制成納米酶?jìng)鞲嘘嚵�。然后通過(guò)鏈霉親和素將多種生物素化抗體專(zhuān)一性固定于微孔傳感陣列。當(dāng)溫育相對(duì)應(yīng)的抗原后,形成的抗體-抗原復(fù)合物會(huì)阻礙化學(xué)發(fā)光底物向Cu/CuO/Cu20納米酶?jìng)鞲薪缑娴臄U(kuò)散通道,最終導(dǎo)致CLI信號(hào)的減少。通過(guò)收集陣列中每個(gè)感應(yīng)微孔的發(fā)光亮度,從而實(shí)現(xiàn)高通量、超靈敏、低消耗的多種疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)。以CEA,CA 125,CA 19-9為模型聯(lián)合標(biāo)志物組,該化學(xué)發(fā)光成像免疫傳感陣列的檢測(cè)線(xiàn)性范圍分別為0.0010-75 ng/mL(CEA)、0.0010-500 U/mL(CA 125)和 0.0010-240 U/mL(CA 19-9),檢測(cè)限低至 0.25 pg/mL(CEA)、2.0×10~(-4)U/mL(CA 125)和1.4×10~(-4) U/mL(CA 19-9)。該基于MOFs衍生物納米酶的無(wú)標(biāo)記免疫傳感陣列可靠,靈敏,簡(jiǎn)便,通量高,為發(fā)展多元生物傳感分析提供了新思路和新平臺(tái)。
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００逡逑ＩｇＧ逡逑圖１．１免疫球蛋白五大類(lèi)別逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｆｉｖｅ邋ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ逡逑Ａｎｔ！９ｅｎ邋ＳｌｉＫｉｎ９邋Ｓｉｔｅｓ邋－邋邋＾邐扢撕．？}0》ｗ；ｗ站ｔ邋0Ｇａｕ擺邐}0逡逑＇＇邋＇＂＾＊＊ＮＳＳＳＳ＾邐Ａｗ？邐Ａ．ｉｏ逡逑％ｖ－邋＾邋＾邋ｖ邋＋逡逑Ｔ邋＾邐－邐■邋ｍ邋ｍ逡逑＝二，知沈邐／、＃邋＼邋／邋＼逡逑ｉ！邋：邐Ｆ邋＿邋ｍ邐？珍銣逡逑，

本文編號(hào)：2698484