【摘要】：阿爾茨海默病(alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,具有強烈的遺傳傾向。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因組中單個核苷酸的變化引起的遺傳物質(zhì)(DNA)序列的多態(tài)性,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等都與SNP有關(guān)。本課題的目的是篩選一種穩(wěn)定可靠地等溫擴增技術(shù),通過檢測與AD相關(guān)基因SNP位點來設(shè)計阿爾海默癥基因診斷試劑盒,從而對該疾病進行早期的診斷和預(yù)防。經(jīng)過文獻調(diào)研和前期實驗結(jié)果,我們初步篩選出65個與AD相關(guān)的SNP位點,并重點探索了基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的三種改進方法:1.智能等溫擴增技術(shù)(Smart amplificaton prcoess,SMAP)利用非對稱性引物設(shè)計和加入TaqMuts錯配修復(fù)蛋白來抑制非特異性擴增,減少假陽性現(xiàn)象的發(fā)生。文中首先提取了人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株(U87)的基因組DNA,設(shè)計了鑒定基因ALDH2 rs671的引物組來驗證了SMAP方法的可行性,對比發(fā)現(xiàn)分型結(jié)果與一代測序結(jié)果一致,而且數(shù)據(jù)顯示TaqMuts錯配修復(fù)蛋白具有明顯減少非特異擴增的作用,只需15 min就可以觀察到分型結(jié)果,40 min可以完成整個擴增過程。但是隨后基因APOE rs429358的分型實驗卻并未成功。2.基于連接反應(yīng)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Ligation-Loop-Mediated Isothermal Amplification,L-LAMP)通過設(shè)計兩條與目標序列互補的發(fā)夾探針,在Taq DNA連接酶的作用下兩條探針可以形成啞鈴狀結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)正好可以作為LAMP反應(yīng)的中間產(chǎn)物啟動LAMP反應(yīng)。文中我們設(shè)計了針對rs429358位點兩條發(fā)夾探針進行檢測,但是實驗結(jié)果并不穩(wěn)定。經(jīng)分析,實驗過程可能出現(xiàn)了發(fā)夾探針錯配或形成二聚體等現(xiàn)象導(dǎo)致連接反應(yīng)失敗或效率降低,從而影響LAMP反應(yīng)的穩(wěn)定性和準確度。3.改進的LAMP(Modified-Loop-Mediated Isothermal Amplification,M-LAMP)該方法引物設(shè)計明顯簡單,對SNP的檢測效率和準確度也顯著提高。文中我們設(shè)計了檢測基因PICALM rs3851179和基因APOE rs429358的兩組引物,數(shù)據(jù)顯示擴增結(jié)果與測序結(jié)果一致。其中引物FIP和BIP除與靶序列互補的部分外5’端連接一段互補的回文序列,該互補的回文序列可以根據(jù)實際要求設(shè)計成通用序列,3’端是待測的SNP位點。與傳統(tǒng)LAMP的產(chǎn)物積累方式不同,由于引物FIP和BIP的5’端特殊結(jié)構(gòu),形成的產(chǎn)物可以相互充當引物,進行下一輪擴增。這樣擴增產(chǎn)物相互串聯(lián),最終形成大量靶序列的串聯(lián)重復(fù)序列產(chǎn)物。結(jié)論:SMAP方法、L-LAMP方法在SNP檢測方面存在一定局限,無法進行大規(guī)模地推廣應(yīng)用。相反,M-LAMP方法具有較高的特異性和穩(wěn)定性,在引物設(shè)計、長片段的擴增、SNP檢測方面都有明顯的優(yōu)勢。M-LAMP方法作為一種新的核酸擴增技術(shù)或SNP檢測技術(shù),具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

阿爾茨海默病風險基因APP主要編碼β-淀粉樣蛋白前體蛋白（APP），PSEN1和PSEN2分別編碼早

指數(shù)擴增技術(shù)的原理示意圖一：（A）NASBA擴增方案
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16;R440

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本文編號：2696983