【摘要】：目的:結(jié)合酶催化活性濃度測(cè)量的特點(diǎn),選擇三個(gè)酶學(xué)項(xiàng)目,采用響應(yīng)面法(RSM)在較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)下獲得各項(xiàng)目的最佳試劑條件、測(cè)量條件及重要影響因素間交互作用情況的信息,以期在酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒研制中獲得最優(yōu)性?xún)r(jià)比。方法:(1)酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒研制項(xiàng)目選擇臨床常規(guī)檢驗(yàn)測(cè)量頻次較高的三個(gè)酶學(xué)項(xiàng)目:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、γ-谷氨�；D(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP);方法學(xué)原理與國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)(JCTLM)推薦的酶學(xué)參考方法基本一致;樣本選擇北京航天總醫(yī)院檢驗(yàn)科血清樣本和參考實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量控制(RELA)樣本,編號(hào)2016Rela-A和2016Rela-B;ALT和GGT項(xiàng)目參考物質(zhì)選擇歐洲標(biāo)準(zhǔn)局(IRMM)歐洲參考物質(zhì)(ERM),ALP項(xiàng)目選擇日本臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(JCCLS)有證參考物質(zhì)(CRM)。(2)采用單因素分析法篩選各酶學(xué)項(xiàng)目影響測(cè)量結(jié)果的重要因素、確定實(shí)驗(yàn)區(qū)域即各影響因素量化后數(shù)值變化范圍。(3)根據(jù)單因素分析法確定的重要影響因素和實(shí)驗(yàn)區(qū)域,采用RSM常用的Box-Behnken設(shè)計(jì)方式確定不同的實(shí)驗(yàn)條件和/或測(cè)量條件組合。(4)在安捷倫CARY100紫外、可見(jiàn)分光光度計(jì)上按Box-Behnken設(shè)計(jì)獲得的實(shí)驗(yàn)條件和/或測(cè)量條件組合配制相應(yīng)的試劑并設(shè)置參數(shù),測(cè)量血清樣本。(5)采用Minitab16軟件分析,建立RSM模型即獲得各酶學(xué)項(xiàng)目測(cè)量結(jié)果與重要影響因素之間的函數(shù)關(guān)系式,預(yù)測(cè)重要影響因素的理論最佳值。(6)固定除重要影響因素外的其他實(shí)驗(yàn)條件,按重要影響因素的理論最佳值配制試劑并設(shè)置參數(shù),測(cè)量RELA樣本,若結(jié)果符合國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)要求(合格范圍±5.25%),RSM模型驗(yàn)證通過(guò),否則根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果調(diào)整實(shí)驗(yàn)區(qū)域后重新實(shí)驗(yàn)。(7)RSM模型驗(yàn)證通過(guò)后,在日立全自動(dòng)生化分析儀7180上進(jìn)行正確度驗(yàn)證,若測(cè)量結(jié)果滿(mǎn)足參考物質(zhì)測(cè)量不確定度(MU)的要求,則正確度驗(yàn)證通過(guò)。結(jié)果:(1)單因素方差分析結(jié)果表明ALT項(xiàng)目各濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);GGT項(xiàng)目各濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);ALP項(xiàng)目各濃度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。確定各酶學(xué)項(xiàng)目影響測(cè)量結(jié)果的重要影響因素分別為ALT:反應(yīng)液p H值、L(+)-丙氨酸濃度、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(β-NADH)濃度;GGT:反應(yīng)液p H值、甘氨酰甘氨酸濃度、L-γ-谷�；�-3-羧基-4-硝基苯胺濃度;ALP:反應(yīng)液p H值、磷酸對(duì)硝基苯酚(4-NPP)濃度、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)濃度。確定實(shí)驗(yàn)區(qū)域分別為ALT:反應(yīng)液p H值(7.05-7.25)、L(+)-丙氨酸濃度(450mmol/l-550mmol/l)、β-NADH濃度(0.13mmol/l-0.23mmol/l);GGT:反應(yīng)液p H值(7.6-7.8)、甘氨酰甘氨酸濃度(140mmol/l-160mmol/l)、L-γ-谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺濃度(4.5mmol/l-5.5mmol/l);ALP:反應(yīng)液p H值(10.0-10.4)、4-NPP濃度(14mmol/l-18mmol/l)、AMP濃度(700mmol/l-800mmol/l)。(2)將各酶學(xué)項(xiàng)目重要影響因素設(shè)置為自變量A、B、C,響應(yīng)值即測(cè)量結(jié)果設(shè)置為因變量Y,獲得RSM函數(shù)關(guān)系式分別為ALT:Y=126.600+2.799A+0.956B+1.048C-6.951A2-3.169B2-3.556C2+0.215AB+0.062AC-0.887BC;GGT:Y=161.607+3.574A+1.221B+1.337C-8.873A2-4.046B2-4.539C2+0.275AB+0.079AC-1.132BC;ALP:Y=404.582+8.947A+3.056B+3.348C-22.212A2-10.128B2-11.365C2+0.688AB+0.198A C-2.834BC。(3)RSM模型預(yù)測(cè)各酶學(xué)項(xiàng)目重要影響因素理論最佳值分別為ALT:反應(yīng)液p H值7.17、L(+)-丙氨酸濃度505.69mmol/l、β-NADH濃度0.17mmol/l;GGT:反應(yīng)液p H值7.72、甘氨酰甘氨酸濃度146.80mmol/l、L-γ-谷�；�-3-羧基-4-硝基苯胺濃度5.06mmol/l;ALP:反應(yīng)液p H值10.24、4-NPP濃度15.83mmol/l、AMP濃度747.28mmol/l。(4)RSM模型驗(yàn)證結(jié)果為ALT:2016Rela-A偏移+0.48%,2016Rela-B偏移+0.92%;GGT:2016Rela-A偏移+0.30%,2016Rela-B偏移+0.85%;ALP:2016Rela-A偏移+1.70%,2016Rela-B偏移-0.41%;各項(xiàng)目偏移幅度均可達(dá)到IFCC±5.25%的要求。(5)正確度驗(yàn)證結(jié)果與參考物質(zhì)靶值相對(duì)偏移分別為ALT:-0.81%,滿(mǎn)足±2.50%參考物質(zhì)MU要求,GGT:-1.19%,滿(mǎn)足±2.10%參考物質(zhì)MU要求,ALP:-2.41%,滿(mǎn)足±3.06%參考物質(zhì)MU要求。結(jié)論:本研究成功建立了ALT、GGT和ALP三個(gè)酶學(xué)項(xiàng)目的RSM模型,有效彌補(bǔ)了傳統(tǒng)單因素分析法的不足,以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)獲得了最佳測(cè)量條件。這一研究大大提高了實(shí)驗(yàn)效率,為推進(jìn)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化和一致化工作奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也為其他體外診斷檢測(cè)試劑盒研發(fā)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化提供了新的思路和參考。
【圖文】：

表 8 ALT 項(xiàng)目各影響因素不同水平設(shè)計(jì)影響因素 水平 1 水平 2 水平 3 水平 4 水平 5pH 值 7.05 7.10 7.15 7.20 7.25)-丙氨酸（mmol/l） 450 475 500 525 550ADH（mmol/l） 0.13 0.155 0.18 0.205 0.231.1.2 ALT 項(xiàng)目單因素分析單因素方差分析結(jié)果表明反應(yīng)液 pH 值、L(+)-丙氨酸濃度、β -NADH 濃度三個(gè)因素對(duì) ALT 酶催化活性濃度的影響在不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=3.70×10-7），因此，所選定的三個(gè)影響因素均為重要影響因素[23,32]。繪制各影響因素與催化活性濃度測(cè)量結(jié)果的趨勢(shì)圖，見(jiàn)圖 6�？梢�(jiàn)單因素實(shí)驗(yàn)所在實(shí)驗(yàn)區(qū)域可包括 ALT 最高催化活性，因此可將水平 3 設(shè)置為 RSM 設(shè)計(jì)中心點(diǎn)[22,32]。

表 14 GGT 項(xiàng)目各影響因素不同水平設(shè)計(jì)影響因素 水平 1 水平 2 水平 3 水平 4 水平 5pH 值 7.6 7.65 7.7 7.75 7.8甘氨酰甘氨酸（mmol/l）140 145 150 155 160L-γ -谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺（mmol/l）4.5 4.75 5.0 5.25 5.52.1.2 GGT 項(xiàng)目單因素分析單因素方差分析結(jié)果表明反應(yīng)液 pH 值、甘氨酰甘氨酸濃度、L-γ -谷�；�-3-羧基-4-硝基苯胺濃度三個(gè)因素對(duì) GGT 酶催化活性濃度的影響在不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=7.91×10-5），，因此所選定的三個(gè)影響因素均為重要影響因素。繪制各影響因素與催化活性濃度測(cè)量結(jié)果的趨勢(shì)圖，見(jiàn)圖 11，可見(jiàn)單因素實(shí)驗(yàn)所在實(shí)驗(yàn)區(qū)域可包括 GGT 最高催化活性。因此可將水平 3 設(shè)置為 RSM 設(shè)計(jì)中心點(diǎn)[22,32]。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2680569