發(fā)布時間：2020-05-10 18:07

【摘要】：感染性疾病是導(dǎo)致公眾死亡的重要原因之一,其對公共衛(wèi)生和公共安全造成了巨大的威脅,這一情況在發(fā)展中國家尤為嚴重。全球每年死于感染性疾病的人數(shù)占了死亡總?cè)藬?shù)的四分之一。革蘭氏陽性菌是臨床患者感染的主要致病菌,其中又以葡萄球菌感染最為常見,它會引起多種致命的疾病,諸如肺炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、菌血癥等。因此,建立快速、簡單、靈敏的革蘭氏陽性菌檢測新方法對于應(yīng)對傳染病爆發(fā)、群體性食物中毒以及其它突發(fā)公共衛(wèi)生事件具有重要的意義。本研究基于達托霉素與革蘭氏陽性菌細胞膜的親和作用,結(jié)合生物發(fā)光法和熒光分析法,構(gòu)建了三種用于革蘭氏陽性菌檢測的新方法。(1)基于達托霉素親和作用的生物發(fā)光分析法檢測革蘭氏陽性活菌本工作基于達托霉素的特異性親和作用,建立了一種新型的生物發(fā)光分析法,用于革蘭氏陽性活菌的快速檢測。達托霉素是一種針對革蘭氏陽性菌的脂肽類抗生素,在Ca~(2+)的作用下,達托霉素與細菌細胞膜之間具有較強的結(jié)合能力。本工作將其偶聯(lián)在磁珠上作為識別試劑,可實現(xiàn)對革蘭氏陽性菌的高效分離和富集。利用十六烷基三甲基溴化銨將捕獲的細菌裂解后,通過熒光素-熒光素酶生物發(fā)光體系檢測釋放出的細胞內(nèi)三磷酸腺苷的含量,進而實現(xiàn)革蘭氏陽性活菌總量檢測。本方法選用了四種革蘭氏陽性菌為模式待檢物,分別是金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌。研究結(jié)果表明,四種細菌的線性范圍均為1.0×10~2-3.0×10~6 CFU mL~(-1),檢測限為33 CFU mL~(-1)。整個檢測過程可在20分鐘內(nèi)完成。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性死菌對本方法幾乎沒有干擾,表明本方法具有良好的特異性。本方法可用于奶酪、牛奶、湖水、人尿液和生理鹽水中革蘭氏陽性活菌的檢測,回收率為75.0%-120.0%。同時,本方法具有靈敏度高,檢測時間短,操作簡便等優(yōu)點,在食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測、臨床診斷和藥品安全等方面有較好的應(yīng)用前景。(2)基于達托霉素功能化磁珠聯(lián)合溶葡萄球菌酶構(gòu)建生物發(fā)光分析法檢測葡萄球菌本工作基于達托霉素和葡萄球菌細胞膜之間的結(jié)合作用,以及溶葡萄球菌酶對葡萄球菌的特異性裂解作用,構(gòu)建了一種用于檢測葡萄球菌的生物發(fā)光分析法。本研究選用達托霉素功能化的磁珠作為識別試劑,可從樣品基質(zhì)中高效地分離和富集葡萄球菌。其后,采用溶葡萄球菌酶作為裂解試劑,基于其對葡萄球菌細胞壁上肽聚糖內(nèi)的五甘氨酸肽鍵橋的水解作用,特異性地裂解葡萄球菌,并釋放出細胞內(nèi)的三磷酸腺苷�；跓晒馑�-熒光素酶生物發(fā)光體系,進而實現(xiàn)對葡萄球菌的定量檢測。本研究以金黃色葡萄球菌為例,研究了該方法用于檢測葡萄球菌的可行性。研究結(jié)果表明,金黃色葡萄球菌的線性范圍是5.0×10~2-5.0×10~6 CFU mL~(-1),檢測限為3.8×10~2 CFU mL~(-1)。整個檢測過程可在20分鐘內(nèi)完成。革蘭氏陰性菌和其它革蘭氏陽性菌對金黃色葡萄球菌的檢測幾乎沒有干擾,表明本方法較好的專一性。該方法可用于牛奶和生理鹽水注射液中金黃色葡萄球菌的檢測,回收率在88.0%-96.0%之間,表明本方法具有較好的應(yīng)用前景。(3)基于雙位點識別的熒光分析法檢測金黃色葡萄球菌本工作基于達托霉素和IgG對金黃色葡萄球菌的雙結(jié)合位點,構(gòu)建了一種基于雙位點識別模式的熒光分析法,可實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的快速檢測。IgG的Fc段可與金黃色葡萄球菌表面的A蛋白特異性結(jié)合,故可作為第一種分子識別試劑捕獲金黃色葡萄球菌。在Ca~(2+)的作用下,達托霉素可將其親脂性尾部插入金黃色葡萄球菌細胞膜從而與細菌緊密結(jié)合�？衫眠@一機制,將熒光素標記的達托霉素作為第二種分子識別試劑。兩種分子識別試劑的聯(lián)用,可提高金黃色葡萄球菌檢測的特異性。革蘭氏陰性菌和其它革蘭氏陽性菌對金黃色葡萄球菌的檢測幾乎沒有干擾。金黃色葡萄球菌的線性范圍是5.0×10~3-5.0×10~8 CFU mL~(-1),檢測限為3.6×10~3 CFU mL~(-1)。該方法操作簡單,不需要破碎細胞,整個檢測過程在90分鐘內(nèi)即可全部完成,且成功應(yīng)用于湖水和生理鹽水中金黃色葡萄球菌的檢測,回收率在87.0%-120.0%之間。
【圖文】：

圖 1-1 全世界主要死亡原因Fig. 1-1 Leading causes of death worldwide.細菌在自然環(huán)境中無處不在，可通過多種途徑進行傳播，例如飲水、食物、空氣和生物接觸。細菌一旦入侵人體免疫系統(tǒng)，就會引起各種癥狀，甚至是引發(fā)一些嚴重的感染性疾病，，如肺炎、腦膜炎、骨髓炎和敗血癥等[4]。由細菌引發(fā)的感染性疾病對人類健康、社會穩(wěn)定和經(jīng)濟發(fā)展造成了巨大的危害。歷史上的三次全球鼠疫大爆發(fā)奪去了上億人的生命[5]。2001 年美國恐怖分子將炭疽芽孢桿菌作為生物武[6,7]

第 1 章 文獻綜述ingfragment），另一個是不能結(jié)合抗原但能與細胞表面的抗體受體結(jié)合的rystallizablefragment）。大多數(shù)抗原結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜且含有多個不同的表位，刺激機體的免疫系統(tǒng)會同時激活多種 B 細胞，產(chǎn)生具有不同表位特異性體。這些抗體被稱為多克隆抗體。相反，單克隆抗體是由單個 B 細胞產(chǎn)對某一特定抗原表位的抗體。由于現(xiàn)代快速生物傳感系統(tǒng)的需要，抗體已品和臨床樣本中致病菌檢測的重要親和配體�？贵w具有很高的靈敏度和固定的抗體可以與微生物表面的抗原相互作用，從而達到識別致病菌的目
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3;R446.5

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6 記者 郭峰;華東醫(yī)藥研發(fā)達托霉素獲批上市[N];杭州日報;2015年

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8 齊繼成 編譯;Cubist向FDA遞交達托霉素新藥申請[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

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10 楊一恭;達托霉素的菌種選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2015年

本文編號：2657687