【摘要】：目的:建立同位素稀釋高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Isotope Dilution Liquid chromatography tandem mass spectrometry,ID LC/MS/MS)測定血清孕酮的參考方法,并開展與常規(guī)免疫方法的比對研究,評價孕酮相關(guān)制備物的互通性,為我國臨床實驗室孕酮檢測的標(biāo)準(zhǔn)化提供理論依據(jù),并且為我國室間質(zhì)量評價(External Quality Assessment,EQA)計劃及標(biāo)準(zhǔn)化計劃遴選合適的質(zhì)評材料。方法:用配制的孕酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和相關(guān)的干擾物摸索色譜質(zhì)譜條件。前處理過程考察了固相萃取和液液萃取。方法確認(rèn)過程評價了不精密度,正確度,回收率,基質(zhì)效應(yīng),檢測限和定量限,不確定度等指標(biāo)。方法的應(yīng)用包括與常規(guī)方法的比對以及評價參考物質(zhì)的互通性。采用單人份血清作為方法學(xué)比對和互通性評價的樣本,待評價的常規(guī)系統(tǒng)包括國內(nèi)和國外品牌的主流分析系統(tǒng),待評價互通性的物質(zhì)有:(1)新鮮冰凍混合人血清;(2)有證標(biāo)物;(3)動物血清;(4)室間質(zhì)量評價質(zhì)控材料;(5)市售第三方質(zhì)控品;(6)去激素血清;(7)環(huán)糊精水溶液。以本研究所建的ID LC/MS/MS方法作為比對方法,其測定的新鮮冰凍血清樣本結(jié)果為X軸,以5種常規(guī)方法測定結(jié)果為Y軸,運用最小二乘法(OLS)進行簡單線性回歸并計算雙側(cè)95%預(yù)測區(qū)間,通過比較剩余標(biāo)準(zhǔn)差與總分析不精密度,以及偏倚等,分析當(dāng)前常規(guī)免疫學(xué)方法存在的主要問題;互通性評價采用了兩種方法,分別為傳統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)方法,即雙側(cè)95%預(yù)測區(qū)間和國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(International Federation Of Clinical Chemistry,IFCC)推薦的偏倚差值法。結(jié)果:孕酮的液相色譜分離采用Waters Symmetry C18色譜柱(3.5μm,2.1 ×10Omm),流速0.2 mL/min,流動相為水(含0.01%乙酸):乙腈(v:v)=35:65,柱溫25℃。此條件下孕酮的保留時間為5.50 min。在API 5000質(zhì)譜儀,電噴霧離子源多反應(yīng)監(jiān)測模式下,選取m/z 315.4→109.2和m/z 318.4→112.4作為定量離子對,m/z 315.4→97.1和m/z 318.4→100.1作為定性離子對。確定的前處理過程為正己烷提取血清孕酮,再用環(huán)糊精提取,最后萃取到甲苯中,氮氣下吹干,流動相重組后上樣檢測。最后用包括法定量。方法的批內(nèi)和總不精密度分別為0.50%-0.58%,0.7%-1.33%。方法相對回收率為99.08%-101.50%。方法比對實驗中,6種常規(guī)方法與ID LC/MS/MS方法擬合的回歸方程的斜率范圍為0.96-1.26,截距為-1.14-0.89 ng/mL。部分常規(guī)系統(tǒng)在低濃度下剩余標(biāo)準(zhǔn)差是分析不精密度的20倍。6個系統(tǒng)的偏倚范圍為-0.20-4.06 ng/mL,相對偏倚在-1.40-18.85%�；ネㄐ栽u價方面,采用傳統(tǒng)95%預(yù)測區(qū)間的方法,自制混合病人血清,國際凍干人血清標(biāo)物ERM DA 347,BCR 348R,國內(nèi)冰凍人血清標(biāo)物GBW09197,09198,09199,以及商品化的去激素血清在6個系統(tǒng)上都具有互通性。環(huán)糊精水溶液明顯超出預(yù)測區(qū)間的下限。使用IFCC推薦的偏倚差值法進行互通性評價時,沒有一個制備物在6個系統(tǒng)上都表現(xiàn)出互通性。結(jié)論:本研究建立了孕酮的同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,方法檢測時間短,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。依據(jù)建立的方法,對常規(guī)免疫方法進行評價,發(fā)現(xiàn)多數(shù)免疫方法存在校準(zhǔn)偏倚和特異性問題。通過對制備物互通性的評價,發(fā)現(xiàn)新鮮冰凍混合人血清在6個評價的系統(tǒng)中均具有良好的互通性。IFCC推薦的偏倚差值法與95%PI方法的互通性評價結(jié)果有一定差異。目的:研究血清載脂蛋白B(apolipoprotein B,apoB)和特定apoB肽段胰蛋白酶酶解過程,考察蛋白或肽段酶解動力學(xué),優(yōu)化apoB肽段液相色譜質(zhì)譜分析條件,探索蛋白類檢驗項目準(zhǔn)確定量時的樣本制備程序,為蛋白質(zhì)的參考測量研究提供實驗基礎(chǔ)。方法:根據(jù)相關(guān)文獻及數(shù)據(jù)庫選擇4種apoB的特異性片段(目標(biāo)肽段)。人工合成目標(biāo)肽段、同位素標(biāo)記目標(biāo)肽段(用作內(nèi)標(biāo))。利用合成的目標(biāo)肽段優(yōu)化色譜質(zhì)譜分析條件。將血清適量內(nèi)標(biāo)混合,在不同酶解條件(胰蛋白酶制劑種類、用量及酶解過程和溫度等)下反應(yīng)不同時間,經(jīng)脫鹽等處理后進行色譜質(zhì)譜分析,記錄目標(biāo)肽段和內(nèi)標(biāo)肽段的絕對峰面積,計算峰面積比值,分析絕對峰面積和峰面積比值隨時間的變化。結(jié)果:本研究選定的特異性片段及其內(nèi)標(biāo)分別為TEVIPPLIENR,TGISPLALIK,SVSLPSLDPASAK,FPEVDVLTK 和 TEVIPPL*IENR,TGISPL*ALIK,SVSLPSL*DPASAK,FPEVDVL*TK(*代表同位素標(biāo)記的氨基酸,使用13C和15N同時標(biāo)記了該氨基酸的6個C和1個N)。研究發(fā)現(xiàn)不同種類的酶對水解效率有很大影響,進而影響整個反應(yīng)的時間。通過選擇合適的胰蛋白酶,在70℃反應(yīng)條件下,目標(biāo)肽段在30miin內(nèi)即可達到最大絕對峰面積,峰面積比也達到最大值。在血清樣本中,4h內(nèi)目標(biāo)肽段的絕對峰面積稍有下降趨勢,其中一個肽段(TGISPLALIK)及其同位素內(nèi)標(biāo)肽段的絕對峰面積下降比較明顯,達70%。在30min到4h的反應(yīng)時間內(nèi),四個肽段的同位素比基本保持穩(wěn)定。結(jié)論:本實驗初步研究了液相色譜質(zhì)譜法測定apoB色譜質(zhì)譜參數(shù)和樣本制備條件,通過選擇合適的胰蛋白酶,優(yōu)化反應(yīng)條件,可以在30min內(nèi)達到最大的水解程度。該結(jié)果提示使用目標(biāo)肽段作為校準(zhǔn)品的可行性,有望通過進一步的氨基酸分析實現(xiàn)向國際單位制(SI)的溯源,從而實現(xiàn)復(fù)雜大分子蛋白的準(zhǔn)確定量。
【圖文】：

范圍ｍ／ｚ：邋２７０－３７０，駐留時間：０．２ｓｅｃ，調(diào)節(jié)質(zhì)譜儀各參數(shù)，發(fā)現(xiàn)影響最大的參數(shù)逡逑是ＤＰ。ＤＰ太高可能會造成待測物的源內(nèi)裂解，選擇不到合適的母離子，適當(dāng)調(diào)節(jié)逡逑ＤＰ和其他參數(shù)，使母離子響應(yīng)強度增高，，最后選定母離子為３１５．４，見下圖２。逡逑１．３ｅ７逡逑１２６７邐Ａ逡逑１．１ｅ７邋ｉ邐【＿】＋逡逑Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ邋ｉｏｎ，邋３１５．４逡逑１．０ｅ７逡逑９．０ｅ６逡逑８．０ｅ６逡逑＾邐７．０ｅ６逡逑Ｉ邋６．０ｅ６逡逑ｏ逡逑Ｓ邋５．０ｅ６逡逑４．０ｅ６逡逑３．０ｅ６１逡逑２．０ｅ６邐Ｉ邐３１邋＇＇逡逑00＞邋＾ｐｌ．Ｔｆｒｉ邋ｉ２Ｈｋｆｒｉ４邋ｕ邋ｉ邋．ｉ邋ｕ＼ｕ，邐ａ．ｐｆｉ邋３３２ＡＪ．．ｆ．３１３邋．ｗｆＭ．ｆ１２．邋ｆｆｎ，．逡逑２７０邐２８０邐２９０邐３００邐３１０邐３２０邐３３０邐３４０邐３５０邐３６０邐３７０逡逑ｍ／ｚ，邋Ｄａ逡逑圖２孕酮母離子質(zhì)譜圖。逡逑對選定的母離子３１５．４進行Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｉｏｎ模式掃描，選定兩個響應(yīng)強度相對逡逑較高的離子作為Ｑ３

圖２孕酮母離子質(zhì)譜圖。逡逑對選定的母離子３１５．４進行Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｉｏｎ模式掃描，選定兩個響應(yīng)強度相對逡逑較高的離子作為Ｑ３，分別為９７．１；邋１０９．２，如下圖３：逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446.6;O657.63

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本文編號：2654797